Robust differensiering av humane iPSCs til en ren populasjon av adipocytter for å studere adipocytt-assosierte lidelser

Summary

Protokollen tillater generering av en ren adipocytpopulasjon fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Retinsyre brukes til å differensiere iPSCs til mesenkymale stamceller (MSC) som brukes til å produsere adipocytter. Deretter brukes en sorteringsmetode basert på Nilrødfarging for å oppnå rene adipocytter.

Abstract

Nylige fremskritt innen indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har gjort det mulig å generere forskjellige celletyper, inkludert adipocytter. Imidlertid har de nåværende differensieringsmetodene lav effektivitet og produserer ikke en homogen populasjon av adipocytter. Her omgår vi dette problemet ved å bruke en all-trans retinoic-basert metode for å produsere mesenkymale stamceller (MSC) i høyt utbytte. Ved å regulere veier som styrer celleproliferasjon, overlevelse og adhesjon, tillater vår differensieringsstrategi effektiv generering av embryonale legemer (EB) som skiller seg ut til en ren populasjon av multipotente MSC-er. Det høye antallet MSC generert av denne metoden gir en ideell kilde for å generere adipocytter. Imidlertid er prøveheterogenitet som følge av adipocytdifferensiering fortsatt en utfordring. Derfor brukte vi en Nilrødbasert metode for rensing av lipidbærende modne adipocytter ved bruk av FACS. Denne sorteringsstrategien tillot oss å etablere en pålitelig måte å modellere adipocytassosierte metabolske forstyrrelser ved å bruke en pool av adipocytter med redusert prøveheterogenitet og forbedret cellefunksjonalitet.

Introduction

Mesenkymale stamceller (MSC) fungerer som en effektiv forbigående ressurs for å produsere celler av mesodermal opprinnelse som adipocytter, osteocytter og kondrocytter, som videre kan brukes til å modellere deres respektive genetiske lidelser. Tidligere tilnærminger baserte seg imidlertid på å oppnå disse MSC-ene fra voksent vev 1, noe som medførte utfordringen med å skaffe dem i høyt antall fra donorene, og begrensningen av å holde dem funksjonelt levedyktige under suboptimale in vitro-kulturforhold ^1,2. Disse hindringene har gitt stor etterspørsel etter å ha en protokoll for generering av MSC-er in vitro. Humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan brukes som en verdifull kilde til MSC, med MSC-egenskaper ^3,4,5. iPSCs-avledede MSCer kan brukes som et terapeutisk alternativ i flere sykdommer. Også evnen til iPSCs-avledede MSCer til å generere adipocytter, gjør dem til en verdifull in vitro menneskelig modell for å studere human adipogenese, fedme og adipocytt-assosierte lidelser.

Nåværende differensieringsprotokoller av adipocytter kan klassifiseres i to grupper, med en som involverer differensiering av adipocytter ved bruk av kjemiske eller proteinbaserte cocktailer som gir et resulterende utbytte på 30% -60% 6,7,8,9, mens den andre involverer genetisk manipulasjon for robust induksjon av viktige transkripsjonsfaktorer som styrer adipocytterutvikling for å gi et utbytte på 80% -90%^{10, 11}. Genetisk manipulasjon rekapitulerer imidlertid ikke den naturlige prosessen med adipocytdifferensiering, og maskerer ofte de subtile paradigmene som kommer under adipogenese, noe som gjør den ineffektiv for sykdomsmodelleringsformål^12,13. Derfor presenterer vi en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra umodne ved fluorescerende merking av lipidbærende adipocytter ved bruk av Nilrød.

Her presenterer vi en protokoll som involverer forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede embryoidlegemer (EB) med all-trans retinsyre for å produsere et høyt antall raskt prolifererende MSC, som videre kan brukes til å generere adipocytter¹⁴. Vi presenterer også en måte å sortere kjemisk avledede modne adipocytter fra det heterogene differensieringsbassenget ved fluorescerende merking av lipiddråpene ved hjelp av et lipofilt fargestoff; Nilen rød. Dette vil tillate generering av en ren populasjon av modne adipocytter med forbedret funksjonalitet for nøyaktig modellering av adipocytassosierte metabolske forstyrrelser.

Protocol

Studien er godkjent av vedkommende institusjonelle forskningsetiske komité og utført i henhold til de etiske standarder som er fastsatt i Helsinkideklarasjonen av 1964 og senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) av HMC (nr. 16260/16) og QBRI (nr. 2016-003). Dette arbeidet er også optimalisert for hESC-er som H1 og H9. Blodprøver ble innhentet fra friske personer med fullt informert samtykke. iPSCene genereres fra mononukleære celler i perif…

Representative Results

Skjematisk og morfologi av celler under mesenkymal differensiering: Differensiering av iPSC til MSC involverer ulike utviklingsstadier som spenner over EB-dannelse, MSC-differensiering og MSC-utvidelse (figur 1). I løpet av disse utviklingsstadiene får cellene forskjellig morfologi på grunn av de forskjellige stimulerende kjemikaliene de blir utsatt for. Ved initiering av differensiering blir cellene belagt med suspensjon og forventes å være runde, med definerte cellekanter, samtidig so…

Discussion

Denne protokollen er svært viktig på grunn av dens evne til å levere MSC-er i høy ytelse og effektivitet. Denne masseskalaproduksjonen av MSC-er ble gjort mulig ved forbigående inkubasjon av iPSCs-avledede EB-er med 10 μM RA^14,15. Forbigående behandling med 10 μM RA forbedret MSC-utbyttet med 11,2 til 1542 fold^14,15, med denne protokollen som gjelder på både iPSCs og hPSCs. Ved denne dosen og be…

Materials

Adiponectin	Abcam	ab22554	Adipocyte maturation marker
anti-CD105	BD Pharmingen	560839	MSC differentiation marker
anti-CD14	BD Pharmingen	561712	MSC differentiation marker
anti-CD19	BD Pharmingen	555415	MSC differentiation marker
anti-CD34	BD Pharmingen	555824	MSC differentiation marker
anti-CD44	abcam	ab93758	MSC differentiation marker
anti-CD45	BD Pharmingen	560975	MSC differentiation marker
anti-CD73	BD Pharmingen	550256	MSC differentiation marker
anti-CD90	BD Pharmingen	555596	MSC differentiation marker
bFGF	R&D	233-FP	MSC culture media supplement
C/EBPA	Abcam	ab40761	Adipocyte maturation marker
Dexamethasone	Torics	1126	Adipocyte differentiation media supplement
FABP4	Abcam	ab93945	Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum	ThermoFisher	10082147	MSC culture media supplement
Glutamax	ThermoFisher	35050-061	MSC culture media supplement
IBMX	Sigma Aldrich	I5879	Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin	Sigma Aldrich	I7378	Adipocyte differentiation media supplement
Insulin	Sigma Aldrich	91077C	Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM	ThermoFisher	12660012	Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM	ThermoFisher	11885084	MSC culturing media
Matrigel	Corning	354230	Coating matrix
MEM-alpha	ThermoFisher	12561056	Adipocyte differentiation media
Nilered	Sigma Aldrich	19123	Sorting marker for adipocyte
Penicillin	ThermoFisher	15140122	MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190144	wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer	Thermo Fisher	28358	wash buffer
PPARG	Cell Signaling Technology	2443	Adipocyte maturation marker
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	Dissociation reagent
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625	MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor	Tocris	1254/10	hPSC culture media supplement
Roziglitazone	Sigma Aldrich	R2408	Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex	ThermoFisher	A334901	hPSC culture media
Triton	Thermo Fisher	28314	Permebealization reagent
Trypsin	ThermoFisher	25200072	Dissociation reagent
Tween 20	Sigma Aldrich	P7942	Wash buffer