استخراج وتنقية بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والكلى والفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية استخراج البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetate من كبد الخنازير والفئران. يمكن تكييف الطرق المذكورة مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديلها للأنسجة الأخرى.
Abstract
فوماريلاسيتواتواتات هيدرولاز يحتوي على البروتين 1 (FAHD1) هو أول عضو محدد في عائلة FAH الفائقة في حقيقيات النوى ، حيث يعمل كأوكسالواسيتات ديكاربوكسيلاز في الميتوكوندريا. تقدم هذه المقالة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. الطرق المغطاة هي كروماتوغرافيا التبادل الأيوني مع كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ، وترشيح هلام تحضيري وتحليلي مع FPLC ، ونهج بروتينية. بعد استخراج البروتين الكلي ، تم استكشاف هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وتم استخراج FAHD1 عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تكييف هذا النهج التمثيلي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية (التي يتم التعبير عنها بمستويات كبيرة) وتعديلها للأنسجة الأخرى. قد يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة.
Introduction
يعمل البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال FAH حقيقيات النواة كثنائي الوظيفة من أوكسالواسيتات (OAA) ديكاربوكسيلاز (ODx)1 وهيدرولاز أسيلبيروفات (ApH)2. وهي مترجمة في الميتوكوندريا 2 وتنتمي إلى عائلة FAH الفائقة الواسعة من الإنزيمات1،2،3،4،5،6. في حين أن نشاط ApH الخاص به ليس له أهمية تذكر فقط ، فإن نشاط ODx الخاص ب FAHD1 يشارك في تنظيم تدفق دورة TCA1،7،8،9. OAA ليس مطلوبا فقط لتفاعل سينثاز السترات المركزي في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل ولكنه يعمل أيضا كمثبط تنافسي لنازعة هيدروجيناز السكسينات كجزء من نظام نقل الإلكترون وكمستقلب كاتابليروتي. أدى انخفاض تنظيم التعبير الجيني FAHD1 في الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVEC) إلى انخفاض كبير في معدل تكاثر الخلايا10 ، وتثبيط كبير لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، المرتبط بالتحول المصاحب إلى تحلل السكر. يشير نموذج العمل إلى خلل الميتوكوندريا المرتبط بالشيخوخة (MiDAS) 11 الشبيه بالنمط الظاهري 8 ، حيث يتم تنظيم مستويات OAA الميتوكوندريا بإحكام بواسطة نشاط FAHD1 1,8,9.
من الأسهل الحصول على البروتين المؤتلف عن طريق التعبير والتنقية من البكتيريا12 بدلا من الأنسجة. ومع ذلك ، قد يكون البروتين المعبر عنه في البكتيريا متحيزا بسبب احتمال عدم وجود تعديلات ما بعد الترجمة ، أو قد يكون ببساطة مشكلة (أي بسبب فقدان البلازميد ، واستجابات الإجهاد البكتيري ، وروابط ثاني كبريتيد المشوهة / غير المشوهة ، وعدم وجود إفراز أو سوء إفراز ، وتجميع البروتين ، والانقسام البروتيني ، وما إلى ذلك). بالنسبة لبعض التطبيقات ، يجب الحصول على البروتين من تحلل الخلايا أو الأنسجة ، من أجل تضمين مثل هذه التعديلات و / أو استبعاد القطع الأثرية المحتملة. يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة لإنزيمات مختارة ، مثل FAHD113.
تقدم هذه المخطوطة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. تتطلب الطرق الموصوفة كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ولكنها تستخدم معدات مختبرية شائعة. يمكن العثور على طرق بديلة في أماكن أخرى14،15،16،17. بعد الاستخراج الكلي للبروتين ، يتضمن البروتوكول المقترح مرحلة اختبار ، حيث تتم مناقشة البروتوكولات الفرعية لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (الشكل 1). بعد تحديد هذه البروتوكولات الفرعية ، يتم استخراج البروتين محل الاهتمام عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع FPLC. وبناء على هذه المبادئ التوجيهية، يمكن تكييف البروتوكول النهائي بشكل فردي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية.
الشكل 1: الاستراتيجية العامة لهذا البروتوكول. من أعلى إلى أسفل: يتم استخراج البروتين من الأنسجة. يتم إعداد تجانس الأنسجة وطردها مركزيا وترشيحها. لكل زوج من العينات الفائقة والمستمدة من الكريات ، يجب إجراء اختبارات لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (FPLC) للتحقيق في الظروف المثلى. بعد إنشاء هذه البروتوكولات الفرعية ، يمكن استخراج البروتين عن طريق إجراء متسلسل لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم ، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم المتكرر (FPLC) عند تركيزات متفاوتة من الأس الهيدروجيني والملح. يجب التحكم في جميع الخطوات بواسطة اللطخة الغربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يعد اتباع الإرشادات الشائعة للتعامل مع البروتينات أمرا ضروريا ، مثل العمل على الجليد وفي ظروف معتدلة من الأس الهيدروجيني والملح. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني مفيد لهذه الطريقة ، في حين يوصى بشدة باستخدام مثبطات البروتيازوم. قد يؤدي تجميد الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والمؤلفان ممتنان جدا للمساعدة التقنية التي قدمتها آيسي أوزتورك وإيفا ألبرتيني. تم الحفاظ على الفئران المستخدمة لتوليد أنسجة الكبد تحت إشراف Uniiv.-Doz. الدكتور بيدر يانسن دور (معهد أبحاث الشيخوخة الطبية الحيوية في جامعة إنسبروك ، Rennweg 10 ، 6020 Innsbruck ، النمسا).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
