Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever
Summary
Dit protocol beschrijft hoe fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) uit varkensnier en muizenlever kan worden geëxtraheerd. De vermelde methoden kunnen worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gewijzigd voor andere weefsels.
Abstract
Fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) is het eerste geïdentificeerde lid van de FAH-superfamilie in eukaryoten, handelend als oxaalacetaatdecarboxylase in mitochondriën. Dit artikel presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnier en muizenlever. Behandelde methoden zijn ionische uitwisselingschromatografie met snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), preparatieve en analytische gelfiltratie met FPLC en proteomische benaderingen. Na totale eiwitextractie werden ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie onderzocht en FAHD1 werd geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze representatieve benadering kan worden aangepast aan andere eiwitten van belang (uitgedrukt in significante niveaus) en worden gewijzigd voor andere weefsels. Gezuiverd eiwit uit weefsel kan de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en / of krachtige en specifieke farmacologische remmers ondersteunen.
Introduction
Het eukaryote FAH-domeinbevattende eiwit 1 (FAHD1) werkt als bifunctioneel oxaalacetaat (OAA) decarboxylase (ODx)1 en acylpyruvaathydrolase (ApH)2. Het is gelokaliseerd in mitochondriën2 en behoort tot de brede FAH-superfamilie van enzymen 1,2,3,4,5,6. Hoewel de ApH-activiteit slechts van ondergeschikt belang is, is de ODx-activiteit van FAHD1 betrokken bij de regulatie van de TCA-cyclusflux 1,7,8,9. OAA is niet alleen nodig voor de centrale citraatsynthasereactie in de tricarbonzuurcyclus, maar fungeert ook als een competitieve remmer van succinaatdehydrogenase als onderdeel van het elektronentransportsysteem en als een kataplerotische metaboliet. Downregulatie van FAHD1-genexpressie in menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVEC) resulteerde in een significante vermindering van de snelheid van celproliferatie10 en significante remming van mitochondriaal membraanpotentiaal, geassocieerd met een gelijktijdige omschakeling naar glycolyse. Het werkmodel verwijst naar mitochondriale disfunctie geassocieerde senescentie (MiDAS)11-achtige fenotype8, waarbij mitochondriale OAA-niveaus strak worden gereguleerd door FAHD1-activiteit 1,8,9.
Recombinant eiwit is gemakkelijker te verkrijgen via expressie en zuivering van bacteriën12 in plaats van uit weefsel. Een eiwit dat tot expressie komt in bacteriën kan echter bevooroordeeld zijn door mogelijk gebrek aan posttranslationele modificaties, of kan eenvoudigweg problematisch zijn (d.w.z. als gevolg van plasmideverlies, bacteriële stressreacties, vervormde / ongevormde disulfidebindingen, geen of slechte secretie, eiwitaggregatie, proteolytische splitsing, enz.). Voor bepaalde toepassingen moet eiwit worden verkregen uit cellysaat of weefsel, om dergelijke modificaties op te nemen en/of mogelijke artefacten uit te sluiten. Gezuiverd eiwit uit weefsel ondersteunt de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en/of krachtige en specifieke farmacologische remmers voor geselecteerde enzymen, zoals voor FAHD113.
Dit manuscript presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnieren en muizenlever. De beschreven methoden vereisen snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), maar maken verder gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Alternatieve methoden zijn elders te vinden 14,15,16,17. Na totale eiwitextractie omvat het voorgestelde protocol een testfase, waarin subprotocollen voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie worden besproken (figuur 1). Na het definiëren van deze subprotocollen wordt het eiwit van belang geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie met FPLC. Op basis van deze richtlijnen kan het uiteindelijke protocol individueel worden aangepast voor andere eiwitten van belang.
Figuur 1: De algemene strategie van dit protocol. Van boven naar beneden: Eiwit wordt gewonnen uit weefsels. Weefselhomogenaat wordt bereid, gecentrifugeerd en gefiltreerd. Voor elk paar supernatant- en pelletmonsters moeten tests voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie (FPLC) worden uitgevoerd om optimale omstandigheden te onderzoeken. Na het vaststellen van deze subprotocollen kan het eiwit worden geëxtraheerd via een sequentiële procedure van ammoniumsulfaatprecipitatie, ionische uitwisselingschromatografie en repetitieve grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC) bij verschillende pH- en zoutconcentraties. Alle stappen moeten worden gecontroleerd door western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
Het volgen van gemeenschappelijke richtlijnen voor de omgang met eiwitten is essentieel, zoals werken op ijs en bij matige pH- en zoutcondities. Het gebruik van proteaseremmers is gunstig voor de methode, terwijl het gebruik van proteasoomremmers ten zeerste wordt aanbevolen. Het invriezen en ontdooien van het monster kan altijd leiden tot eiwitprecipitatie (ten minste gedeeltelijk), dus elk ontdooide aliquot van initieel eiwitlysaat (stap 2) moet continu worden verwer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn erg dankbaar voor de technische assistentie van Ayse Öztürk en Eva Albertini. Muizen die werden gebruikt voor het genereren van leverweefsel werden onderhouden onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
