Ekstraktion og oprensning af FAHD1-protein fra svinenyre og muselever
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man ekstraherer fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) fra svinenyre og muselever. De anførte metoder kan tilpasses andre proteiner af interesse og modificeres til andre væv.
Abstract
Fumarylacetoacetathydrolasedomæneholdigt protein 1 (FAHD1) er det første identificerede medlem af FAH-superfamilien i eukaryoter, der fungerer som oxaloacetatdecarboxylase i mitokondrier. Denne artikel præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. Omfattede metoder er ionisk udvekslingskromatografi med hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), præparativ og analytisk gelfiltrering med FPLC og proteomiske tilgange. Efter total proteinekstraktion blev ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi undersøgt, og FAHD1 blev ekstraheret via en sekventiel strategi ved anvendelse af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi. Denne repræsentative tilgang kan tilpasses andre proteiner af interesse (udtrykt i signifikante niveauer) og modificeres til andre væv. Oprenset protein fra væv kan understøtte udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere.
Introduction
Det eukaryote FAH-domæneholdige protein 1 (FAHD1) virker som bifunktionelt oxaloacetanat (OAA) decarboxylase (ODx)1 og acylpyruvathydrolase (ApH)2. Det er lokaliseret i mitokondrier2 og tilhører den brede FAH-superfamilie af enzymer 1,2,3,4,5,6. Mens dens ApH-aktivitet kun er af mindre relevans, er ODx-aktiviteten af FAHD1 involveret i reguleringen af TCA-cyklusfluxen 1,7,8,9. OAA er ikke kun nødvendig for den centrale citratsyntasereaktion i tricarboxylsyrecyklussen, men fungerer også som en konkurrencedygtig hæmmer af succinatdehydrogenase som en del af elektrontransportsystemet og som en kataplerotisk metabolit. Nedregulering af FAHD1-genekspression i humane navlestrengsendotelceller (HUVEC) resulterede i en signifikant reduktion i hastigheden af celleproliferation10 og signifikant hæmning af mitokondriemembranpotentiale forbundet med en samtidig skift til glykolyse. Arbejdsmodellen refererer til mitokondriel dysfunktion associeret ældning (MiDAS)11-lignende fænotype8, hvor mitokondrielle OAA-niveauer er tæt reguleret af FAHD1-aktivitet 1,8,9.
Rekombinant protein er lettere at opnå via ekspression og oprensning fra bakterier12 snarere end fra væv. Imidlertid kan et protein udtrykt i bakterier være forudindtaget af mulig mangel på post-translationelle modifikationer eller kan simpelthen være problematisk (dvs. på grund af plasmidtab, bakterielle stressresponser, forvrængede / uformede disulfidbindinger, ingen eller dårlig sekretion, proteinaggregering, proteolytisk spaltning osv.). Til visse anvendelser skal protein udtages fra cellelysat eller væv for at inkludere sådanne ændringer og/eller for at udelukke mulige artefakter. Oprenset protein fra væv understøtter udviklingen af antistoffer af høj kvalitet og/eller potente og specifikke farmakologiske hæmmere for udvalgte enzymer, f.eks. for FAHD113.
Dette manuskript præsenterer en række metoder til ekstraktion og oprensning af FAHD1 fra svinenyre og muselever. De beskrevne metoder kræver hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC), men bruger ellers almindeligt laboratorieudstyr. Alternative metoder kan findes andre steder 14,15,16,17. Efter total proteinekstraktion involverer den foreslåede protokol en testfase, hvor underprotokoller for ammoniumsulfatudfældning og ionbytningskromatografi diskuteres (figur 1). Efter at have defineret disse underprotokoller ekstraheres proteinet af interesse via en sekventiel strategi ved hjælp af ionisk udveksling og størrelsesudelukkelseskromatografi med FPLC. På grundlag af disse retningslinjer kan slutprotokollen tilpasses individuelt til andre proteiner af interesse.
Figur 1: Den overordnede strategi for denne protokol. Fra top til bund: Protein ekstraheres fra væv. Vævshomogenat fremstilles, centrifugeres og filtreres. For hvert par prøver af supernatant og pelletsafledte skal der udføres test for ammoniumsulfatudfældning og ionisk udvekslingskromatografi (FPLC) for at undersøge optimale betingelser. Efter fastlæggelse af disse underprotokoller kan proteinet ekstraheres via en sekventiel procedure for ammoniumsulfatudfældning, ionisk udvekslingskromatografi og repetitiv størrelseseksklusionskromatografi (FPLC) ved varierende pH- og saltkoncentrationer. Alle trin skal styres af western blot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
At følge fælles retningslinjer for håndtering af proteiner er afgørende, såsom at arbejde på is og ved moderate pH- og saltforhold. Anvendelsen af proteasehæmmere er gavnlig for metoden, mens brugen af proteasomhæmmere anbefales stærkt. Frysning og optøning af prøven kan altid resultere i proteinudfældning (i det mindste delvist), så enhver optøet alikvot initialproteinlysat (trin 2) skal behandles kontinuerligt uden pause. Centrifugering og filtrering efter o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er meget taknemmelige for den tekniske bistand fra Ayse Öztürk og Eva Albertini. Mus, der blev brugt til generering af levervæv, blev opretholdt under tilsyn af Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Institut for Biomedicinsk Aldringsforskning ved Innsbruck Universitet, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Østrig).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
