Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus
Summary
Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.
Abstract
L’expression hétérologue des connexines et des innexines dans les ovocytes xenopus est une approche puissante pour étudier les propriétés biophysiques des jonctions lacunaires (GJ). Cependant, cette approche est techniquement difficile car elle nécessite une pince de tension différentielle de deux ovocytes opposés partageant un terrain d’entente. Bien qu’un petit nombre de laboratoires aient réussi à exécuter cette technique, pratiquement tous ont utilisé des amplificateurs faits maison ou des amplificateurs commerciaux conçus pour les enregistrements à un seul ovocyte. Il est souvent difficile pour d’autres laboratoires de mettre en œuvre cette technique. Bien qu’un mode de mesure de courant latéral élevé ait été incorporé dans un amplificateur commercial pour les enregistrements à double tension ovocytaire, il n’y avait eu aucun rapport pour son application jusqu’à notre étude récente. Nous avons rendu l’approche de mesure du courant latéral élevé plus pratique et pratique en introduisant plusieurs modifications techniques, notamment la construction d’une plate-forme d’enregistrement magnétique qui permet un placement précis des ovocytes et de diverses électrodes, l’utilisation de la solution de bain comme conducteur dans les électrodes différentielles de tension, l’adoption d’une électrode KCl commerciale à faible fuite comme électrode de référence, fabrication d’électrodes de courant et de tension à partir de capillaires en verre à paroi mince et positionnement de toutes les électrodes à l’aide de dispositifs magnétiques. La méthode décrite ici permet des enregistrements pratiques et robustes du courant jonctionnel (Ij) entre deux ovocytes Xenopus opposés.
Introduction
Les GJ sont des canaux intercellulaires qui peuvent permettre le flux de courant et l’échange de petites molécules cytosoliques entre les cellules voisines. Ils existent dans de nombreux types de cellules et remplissent diverses fonctions physiologiques. Les GJ chez les vertébrés sont formés par les connexines, tandis que ceux chez les invertébrés par les innexines. Chaque GJ se compose de deux hémicanaux juxtaposés avec 6 ou 8 sous-unités par hémicanal, selon qu’il s’agit de connexines ou d’innexines 1,2,3. Les humains ont 21 gènesde connexine 4, tandis que les modèles d’invertébrés couramment utilisés C. elegans et Drosophila melanogaster ont 25 et 8 gènes d’innexine, respectivement 5,6. L’épissage alternatif des transcriptions de gènes peut encore augmenter la diversité des protéines GJ, au moins pour les innexines 7,8.
Les JJ peuvent être divisés en trois catégories en fonction de leur composition moléculaire : homotypique, hétérotypique et hétéromérique. Un GJ homotypique a toutes ses sous-unités identiques. Un GJ hétérotypique a deux hémicanaux homomériques, mais les deux hémicanaux sont formés par deux protéines GJ différentes. Un GJ hétéromérique contient au moins un hémicanal hétéromérique. Les diversités moléculaires des MJ peuvent conférer des propriétés biophysiques distinctes qui sont importantes pour leurs fonctions physiologiques. Les propriétés biophysiques de GJ sont également modulées par les protéines régulatrices9. Pour comprendre comment les MJ remplissent leurs fonctions physiologiques, il est important de connaître leurs compositions moléculaires, leurs propriétés biophysiques et le rôle des protéines régulatrices dans leurs fonctions.
Les systèmes d’expression hétérologues sont souvent utilisés pour étudier les propriétés biophysiques des canaux ioniques, y compris les GJ, et les effets des protéines régulatrices sur eux. Parce que les systèmes d’expression hétérologue permettent l’expression de protéines spécifiques, ils sont généralement plus aptes à disséquer les fonctions protéiques que les tissus natifs où les protéines avec des fonctions redondantes peuvent compliquer l’analyse, et l’enregistrement de Ij peut être inaccessible. Malheureusement, les lignées cellulaires les plus couramment utilisées, à l’exception de la cellule Neuro-2A, sont inappropriées pour étudier les propriétés biophysiques du GJ en raison de complications par les connexines endogènes. Même les cellules Neuro-2A ne sont pas toujours appropriées pour ce type d’analyse. Par exemple, nous n’avons pu détecter aucun Ij dans les cellules Neuro-2A transfectées avec les innexines UNC-7 et UNC-9 en l’absence ou la présence d’UNC-1 (non publié), ce qui est nécessaire pour la fonction des UNC-9 GJs dans C. elegans 9,10. D’autre part, les ovocytes Xenopus sont un système alternatif utile pour les analyses électrophysiologiques des JJ. Bien qu’ils expriment une protéine GJ endogène, la connexine 38 (Cx38)11, les complications potentielles peuvent être facilement évitées en injectant un oligonucléotide antisens spécifique12. Cependant, les analyses de GJ avec des ovocytes Xenopus nécessitent une pince de tension différentielle de deux cellules juxtaposées, ce qui est techniquement difficile. Les premiers succès de la pince à double tension des blastomères de grenouille ont été rapportés il y a environ 40 ans13,14. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé cette technique pour enregistrer Ij dans des ovocytes Xenopus appariés. Cependant, pratiquement toutes les études précédentes ont été réalisées avec des amplificateurs faits maison 12,15,16 ou des amplificateurs commerciaux conçus pour des enregistrements sur des ovocytes simples (GeneClamp 500, AxoClamp 2A ou AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Parce que même les amplificateurs commerciaux ne fournissent pas d’instructions pour la pince de tension à double ovocyte, il est souvent difficile pour les laboratoires électrophysiologiques nouveaux ou moins sophistiqués de mettre en œuvre cette technique.
Un seul amplificateur commercial a été développé pour la pince à double tension ovocytaire, l’OC-725C de Warner Instruments (Table des matériaux, Figure 1A). Cet amplificateur peut être utilisé en mode standard (pour les ovocytes simples) ou en mode de mesure à courant latéral élevé (pour les ovocytes simples ou doubles) selon que deux prises de sa sonde de tension sont connectées (Figure 1B, C). Cependant, jusqu’à notre récente étude7, il n’y avait pas eu une seule publication décrivant l’utilisation de cet amplificateur dans son mode de mesure à courant latéral élevé. Bien que l’amplificateur ait été utilisé par un autre laboratoire pour les enregistrements à double ovocyte, il a été utilisé dans le mode standard plutôt que dans le mode côté haut21,22. Ce manque de rapports utilisant l’amplificateur dans son mode de mesure de courant latéral élevé peut être dû à des difficultés techniques. Nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des enregistrements stables à double ovocyte en utilisant le mode côté haut en suivant les instructions du fabricant. Au fil des ans, nous avons essayé trois approches différentes pour les enregistrements à double ovocyte, notamment en utilisant deux amplificateurs OC-725C en mode de mesure à courant latéral élevé, deux amplificateurs OC-725C en mode standard et deux amplificateurs d’un autre fabricant. Nous n’avons finalement réussi à obtenir des enregistrements stables qu’avec la première approche après de nombreux essais et erreurs. Cette publication décrit et démontre les procédures que nous utilisons pour exprimer les protéines GJ dans les ovocytes Xenopus, enregistrer Ij en utilisant le mode de mesure du courant latéral élevé et analyser les données électrophysiologiques à l’aide de logiciels commerciaux populaires. Des informations supplémentaires sur la technique de la double tension-pince peuvent être trouvées dans d’autres publications19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’optimisation du système semble nécessaire pour les expériences à double tension ovocytaire-pince. Sans cela, les enregistrements peuvent être très instables et les amplificateurs peuvent avoir à injecter une quantité excessive de courant pour atteindre la Vm cible, ce qui entraîne des dommages aux ovocytes et des échecs d’enregistrement. Plusieurs facteurs sont essentiels pour obtenir des enregistrements stables de deux ovocytes avec la méthode de mesure du courant latéral élevé. Tout d’abo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Haiying Zhan, Qian Ge pour leur implication dans la phase initiale du développement technique, Kiranmayi Vedantham pour leur aide avec les chiffres, et le Dr Camillo Peracchia pour ses conseils sur la chambre d’appariement des ovocytes.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
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