Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Gap-Junction-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren und den Sperrschichtstrom zwischen zwei apponierten Eizellen mit einem kommerziellen Verstärker aufzuzeichnen, der für Dual-Eizellen-Spannungs-Clamp-Aufnahmen in einem hohen Seitenstrom-Messmodus entwickelt wurde.
Abstract
Die heterologe Expression von Connexinen und Innexinen in Xenopus-Eizellen ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von Gap Junctions (GJs). Dieser Ansatz ist jedoch technisch anspruchsvoll, da er eine Differenzspannungsklemme von zwei gegenüberliegenden Eizellen erfordert, die eine gemeinsame Basis haben. Obwohl es einer kleinen Anzahl von Labors gelungen ist, diese Technik durchzuführen, haben im Wesentlichen alle entweder hausgemachte Verstärker oder kommerzielle Verstärker verwendet, die für Einzeleizellaufnahmen entwickelt wurden. Für andere Labore ist es oft eine Herausforderung, diese Technik zu implementieren. Obwohl ein High-Side-Strom-Messmodus in einen kommerziellen Verstärker für Dual-Oozyten-Spannungs-Clamp-Aufnahmen integriert wurde, gab es bis zu unserer jüngsten Studie keinen Bericht über seine Anwendung. Wir haben den Ansatz der Hochstrommessung durch die Einführung mehrerer technischer Modifikationen praktischer und bequemer gemacht, darunter die Konstruktion einer magnetbasierten Aufzeichnungsplattform, die eine präzise Platzierung von Eizellen und verschiedenen Elektroden ermöglicht, die Verwendung der Badlösung als Leiter in spannungsdifferenzierten Elektroden, die Verwendung einer kommerziellen KCl-Elektrode mit geringer Leckage als Referenzelektrode, Herstellung von Strom- und Spannungselektroden aus dünnwandigen Glaskapillaren und Positionierung aller Elektroden mit magnetisch basierten Geräten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht bequeme und robuste Aufnahmen von Sperrschichtströmen (Ij) zwischen zwei gegenüberliegenden Xenopus-Eizellen .
Introduction
GJs sind interzelluläre Kanäle, die den Stromfluss und den Austausch kleiner zytosolischer Moleküle zwischen benachbarten Zellen ermöglichen können. Sie kommen in vielen Zelltypen vor und erfüllen vielfältige physiologische Funktionen. GJs werden bei Wirbeltieren durch Connexine gebildet, bei Wirbellosen durch Innexine. Jedes GJ besteht aus zwei nebeneinander gestellten Hemikanälen mit entweder 6 oder 8 Untereinheiten pro Hemikanal, je nachdem, ob es sich um Connexine oder Innexine 1,2,3 handelt. Menschen haben 21 Connexin-Gene4, während die häufig verwendeten wirbellosen Modelle C. elegans und Drosophila melanogaster 25 bzw. 8 Innexin-Gene bzw. 5,6 aufweisen. Das alternative Spleißen von Gentranskripten kann die Vielfalt der GJ-Proteine zumindest für Innexine weiter erhöhen 7,8.
GJs können basierend auf molekularen Zusammensetzungen in drei Kategorien unterteilt werden: homotypisch, heterotypisch und heteromerisch. Ein homotypisches GJ hat alle seine Untereinheiten, die identisch sind. Ein heterotypisches GJ hat zwei homomere Hemikanäle, aber die beiden Hemikanäle werden von zwei verschiedenen GJ-Proteinen gebildet. Ein heteromerer GJ enthält mindestens einen heteromeren Hemikanal. Die molekularen Diversitäten von GJs können unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften verleihen, die für ihre physiologischen Funktionen wichtig sind. Die biophysikalischen Eigenschaften von GJ werden auch durch regulatorische Proteinemoduliert 9. Um zu verstehen, wie GJs ihre physiologischen Funktionen erfüllen, ist es wichtig, ihre molekulare Zusammensetzung, biophysikalischen Eigenschaften und die Rolle regulatorischer Proteine in ihren Funktionen zu kennen.
Heterologe Expressionssysteme werden häufig verwendet, um biophysikalische Eigenschaften von Ionenkanälen, einschließlich GJs, und die Auswirkungen von regulatorischen Proteinen auf sie zu untersuchen. Da heterologe Expressionssysteme die Expression spezifischer Proteine ermöglichen, sind sie im Allgemeinen anfälliger für die Sezierung von Proteinfunktionen als native Gewebe, in denen Proteine mit redundanten Funktionen die Analyse erschweren können und die Aufzeichnung von Ij unerreichbar sein kann. Leider sind die am häufigsten verwendeten Zelllinien mit Ausnahme der Neuro-2A-Zelle aufgrund von Komplikationen durch endogene Connexine für die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von GJ ungeeignet. Selbst Neuro-2A-Zellen sind für diese Art der Analyse nicht immer geeignet. Zum Beispiel konnten wir keine I j inNeuro-2A-Zellen nachweisen, die mit den Innexinen UNC-7 und UNC-9 transfiziert wurden, weder in Abwesenheit noch in Anwesenheit von UNC-1 (unveröffentlicht), was für die Funktion von UNC-9 GJs in C. elegans 9,10 erforderlich ist. Auf der anderen Seite sind Xenopus-Eizellen ein nützliches alternatives System für elektrophysiologische Analysen von GJs. Obwohl sie ein endogenes GJ-Protein, Connexin 38 (Cx38)11, exprimieren, können mögliche Komplikationen leicht vermieden werden, indem ein spezifisches Antisense-Oligonukleotid12 injiziert wird. Analysen von GJs mit Xenopus-Eizellen erfordern jedoch eine differenzielle Spannungsklemme von zwei nebeneinander liegenden Zellen, was technisch eine Herausforderung darstellt. Die frühesten Erfolge der Doppelspannungsklemme von Froschblastomeren wurden vor etwa 40 Jahrenberichtet 13,14. Seitdem haben viele Studien diese Technik verwendet, um Ij in gepaarten Xenopus-Eizellen aufzuzeichnen. Im Wesentlichen wurden jedoch alle früheren Studien entweder mit hausgemachten Verstärkern 12,15,16 oder kommerziellen Verstärkern durchgeführt, die für Aufnahmen auf einzelnen Eizellen entwickelt wurden (GeneClamp 500, AxoClamp 2A oder AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Da selbst die kommerziellen Verstärker keine Anweisungen für die doppelte Eizellenspannungsklemme enthalten, ist es für neue oder weniger anspruchsvolle elektrophysiologische Labore oft eine Herausforderung, diese Technik zu implementieren.
Für die doppelte Eizellenspannungsklemme wurde nur ein kommerzieller Verstärker entwickelt, der OC-725C von Warner Instruments (Materialtabelle, Abbildung 1A). Dieser Verstärker kann entweder in einem Standardmodus (für einzelne Eizellen) oder in einem hohen Seitenstrommessmodus (für einzelne oder zwei Eizellen) verwendet werden, je nachdem, ob zwei Steckdosen in seiner Spannungssonde angeschlossen sind (Abbildung 1B, C). Bis zu unserer jüngsten Studie7 gab es jedoch keine einzige Publikation, die den Einsatz dieses Verstärkers in seinem hohen Seitenstrommessmodus beschrieb. Obwohl der Verstärker von einem anderen Labor für Dual-Eizellenaufnahmen verwendet wurde, wurde er eher im Standard- als im High-Side-Modus21,22 verwendet. Dieser Mangel an Berichten, die den Verstärker in seinem High-Side-Strom-Messmodus verwenden, könnte auf technische Schwierigkeiten zurückzuführen sein. Wir waren nicht in der Lage, stabile Dual-Eizellen-Aufnahmen mit dem High-Side-Modus zu erhalten, indem wir den Anweisungen des Herstellers folgten. Im Laufe der Jahre haben wir drei verschiedene Ansätze für duale Eizellenaufnahmen ausprobiert, darunter die Verwendung von zwei OC-725C-Verstärkern im High-Side-Strommessmodus, zwei OC-725C-Verstärkern im Standardmodus und zwei Verstärkern eines anderen Herstellers. Stabile Aufnahmen gelang uns schließlich erst mit dem ersten Ansatz nach ausgiebigem Versuch und Irrtum. Diese Veröffentlichung beschreibt und demonstriert die Verfahren, die wir verwenden, um GJ-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren, Ij mit dem Hochstrom-Messmodus aufzuzeichnen und die elektrophysiologischen Daten mit gängiger kommerzieller Software zu analysieren. Weitere Informationen über die Doppelspannungsklemmtechnik finden sich in anderen Veröffentlichungen19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Systemoptimierung scheint für Dual-Eizellen-Spannungs-Klemm-Experimente notwendig zu sein. Ohne sie können Aufnahmen sehr instabil sein, und die Verstärker müssen möglicherweise eine übermäßige Menge an Strom injizieren, um die Zielvm zu erreichen, was zu Eizellschäden und Aufzeichnungsfehlern führt. Mehrere Faktoren sind entscheidend, um stabile duale Eizellenaufzeichnungen mit der High-Side-Current-Messmethode zu erhalten. Erstens müssen die Strom- und Spannungselektroden einen angemessenen Wid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Haiying Zhan, Qian Ge für ihre Beteiligung an der Anfangsphase der technischen Entwicklung, Kiranmayi Vedantham für die Hilfe bei den Figuren und Dr. Camillo Peracchia für die Beratung zur Eizellpaarungskammer.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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