Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus
Summary
Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.
Abstract
La expresión heteróloga de conexinas e inexinas en ovocitos de Xenopus es un enfoque poderoso para estudiar las propiedades biofísicas de las uniones de brecha (GJ). Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante porque requiere una pinza de voltaje diferencial de dos ovocitos opuestos que comparten un terreno común. Aunque un pequeño número de laboratorios han logrado realizar esta técnica, esencialmente todos ellos han utilizado amplificadores caseros o amplificadores comerciales que fueron diseñados para grabaciones de un solo ovocito. A menudo es un desafío para otros laboratorios implementar esta técnica. Aunque se ha incorporado un modo de medición de alta corriente lateral en un amplificador comercial para grabaciones de abrazadera de voltaje de oocitos duales, no había habido ningún informe para su aplicación hasta nuestro estudio reciente. Hemos hecho que el enfoque de medición de alta corriente lateral sea más práctico y conveniente mediante la introducción de varias modificaciones técnicas, incluida la construcción de una plataforma de grabación basada magnéticamente que permite la colocación precisa de ovocitos y varios electrodos, el uso de la solución de baño como conductor en electrodos diferenciales de voltaje, la adopción de un electrodo KCl comercial de baja fuga como electrodo de referencia, fabricación de electrodos de corriente y voltaje a partir de capilares de vidrio de pared delgada, y posicionamiento de todos los electrodos utilizando dispositivos basados magnéticamente. El método descrito aquí permite registros convenientes y robustos de la corriente de unión (Ij) entre dos ovocitos xenopus opuestos .
Introduction
Los CG son canales intercelulares que pueden permitir el flujo de corriente y el intercambio de pequeñas moléculas citosólicas entre las células vecinas. Existen en muchos tipos de células y realizan diversas funciones fisiológicas. Los GJ en vertebrados están formados por conexinas, mientras que los de invertebrados por inexinas. Cada GJ consta de dos hemicanales yuxtapuestos con 6 u 8 subunidades por hemical, dependiendo de si son conexinas o inexinas 1,2,3. Los seres humanos tienen 21 genesde conexina 4, mientras que los modelos de invertebrados comúnmente utilizados C. elegans y Drosophila melanogaster tienen 25 y 8 genes de inexina, respectivamente 5,6. El empalme alternativo de las transcripciones de genes puede aumentar aún más la diversidad de las proteínas GJ, al menos para las inexinas 7,8.
Los CG se pueden dividir en tres categorías basadas en composiciones moleculares: homotípicas, heterotípicas y heteroméricas. Un GJ homotípico tiene todas sus subunidades siendo idénticas. Un GJ heterotípico tiene dos hemicales homoméricos, pero los dos hemicanales están formados por dos proteínas GJ diferentes. Un GJ heteromérico contiene al menos un hemicanal heteromérico. Las diversidades moleculares de los GJ pueden conferir distintas propiedades biofísicas que son importantes para sus funciones fisiológicas. Las propiedades biofísicas de GJ también son moduladas por proteínas reguladoras9. Para comprender cómo los GJ realizan sus funciones fisiológicas, es importante conocer sus composiciones moleculares, propiedades biofísicas y el papel de las proteínas reguladoras en sus funciones.
Los sistemas de expresión heterólogos se utilizan a menudo para estudiar las propiedades biofísicas de los canales iónicos, incluidos los CG, y los efectos de las proteínas reguladoras en ellos. Debido a que los sistemas de expresión heteróloga permiten la expresión de proteínas específicas, generalmente son más susceptibles de diseccionar funciones de proteínas que los tejidos nativos donde las proteínas con funciones redundantes pueden complicar el análisis, y el registro de Ij puede ser inalcanzable. Desafortunadamente, las líneas celulares más comúnmente utilizadas, excepto la célula Neuro-2A, son inapropiadas para estudiar las propiedades biofísicas de GJ debido a complicaciones por las conexinas endógenas. Incluso las células Neuro-2A no siempre son apropiadas para este tipo de análisis. Por ejemplo, no pudimos detectar ningún Ij en células Neuro-2A transfectadas con las inexinas UNC-7 y UNC-9 ni en ausencia ni en presencia de UNC-1 (no publicado), lo que es necesario para la función de unC-9 GJs en C. elegans 9,10. Por otro lado, los ovocitos Xenopus son un sistema alternativo útil para los análisis electrofisiológicos de GJs. Aunque expresan una proteína GJ endógena, la conexina 38 (Cx38)11, las posibles complicaciones se pueden evitar fácilmente inyectando un oligonucleótido antisentidoespecífico 12. Sin embargo, los análisis de GJ con ovocitos xenopus requieren una pinza de voltaje diferencial de dos células yuxtapuestas, lo cual es técnicamente un desafío. Los primeros éxitos de la abrazadera de doble voltaje de los blastómeros de rana se informaron hace unos 40 años13,14. Desde entonces, muchos estudios han utilizado esta técnica para registrar Ij en ovocitos de Xenopus pareados. Sin embargo, esencialmente todos los estudios previos se han realizado con amplificadores caseros 12,15,16 o amplificadores comerciales diseñados para grabaciones en ovocitos individuales (GeneClamp 500, AxoClamp 2A o AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Debido a que incluso los amplificadores comerciales no proporcionan instrucciones para la abrazadera de voltaje de doble ovocito, a menudo es un desafío para los laboratorios electrofisiológicos nuevos o menos sofisticados implementar esta técnica.
Solo se ha desarrollado un amplificador comercial para abrazadera de voltaje de doble ovocito, el OC-725C de Warner Instruments (Tabla de Materiales, Figura 1A). Este amplificador se puede utilizar en un modo estándar (para ovocitos individuales) o en un modo de medición de alta corriente lateral (para ovocitos simples o dobles) dependiendo de si dos tomas en su sonda de voltaje están conectadas (Figura 1B, C). Sin embargo, hasta nuestro reciente estudio7, no había habido una sola publicación que describiera el uso de este amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral. Aunque el amplificador ha sido utilizado por otro laboratorio para grabaciones de ovocitos duales, se utilizó en el modo estándar en lugar del modo de lado alto21,22. Esta falta de informes sobre el uso del amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral podría deberse a dificultades técnicas. No fue posible obtener grabaciones de ovocitos duales estables utilizando el modo de lado alto siguiendo las instrucciones del fabricante. A lo largo de los años, hemos probado tres enfoques diferentes para grabaciones de ovocitos duales, incluido el uso de dos amplificadores OC-725C en el modo de medición de alta corriente lateral, dos amplificadores OC-725C en el modo estándar y dos amplificadores de otro fabricante. Finalmente logramos obtener grabaciones estables solo con el primer enfoque después de un extenso ensayo y error. Esta publicación describe y demuestra los procedimientos que utilizamos para expresar las proteínas GJ en los ovocitos xenopus, registrar Ij utilizando el modo de medición de alta corriente lateral y analizar los datos electrofisiológicos utilizando un software comercial popular. Puede encontrarse información adicional sobre la técnica de doble pinza de voltaje en otras publicaciones19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
La optimización del sistema parece ser necesaria para los experimentos de pinza de voltaje de ovocitos duales. Sin él, las grabaciones pueden ser altamente inestables, y los amplificadores pueden tener que inyectar una cantidad excesiva de corriente para llegar al Vm objetivo, lo que resulta en daños en los ovocitos y fallas de grabación. Varios factores son críticos para obtener registros de ovocitos duales estables con el método de medición de corriente lateral alta. Primero, los electrodos de corriente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Haiying Zhan, Qian Ge por su participación en la etapa inicial del desarrollo técnico, Kiranmayi Vedantham por ayudar con las figuras y al Dr. Camillo Peracchia por el asesoramiento sobre la cámara de emparejamiento de ovocitos.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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