Optagelse af gap junction strøm fra Xenopus Oocytter
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udtrykke gap junction proteiner i Xenopus oocytter og registrere junctional strøm mellem to apposed oocytter ved hjælp af en kommerciel forstærker designet til dual oocyt spændingsklemme optagelser i en høj sidestrøm målemodus.
Abstract
Heterolog ekspression af connexiner og innexiner i Xenopus oocytter er en stærk tilgang til at studere de biofysiske egenskaber ved gap junctions (GJs). Denne tilgang er imidlertid teknisk udfordrende, fordi den kræver en differentiel spændingsklemme af to modsatte oocytter, der deler et fælles grundlag. Selvom et lille antal laboratorier har formået at udføre denne teknik, har stort set alle brugt enten hjemmelavede forstærkere eller kommercielle forstærkere, der var designet til single-oocytoptagelser. Det er ofte udfordrende for andre laboratorier at implementere denne teknik. Selvom en høj sidestrømsmålemodus er blevet indarbejdet i en kommerciel forstærker til dobbelt oocytspændingsklemmeoptagelser, havde der ikke været nogen rapport om dens anvendelse før vores nylige undersøgelse. Vi har gjort højsidestrømsmålemetoden mere praktisk og praktisk ved at introducere flere tekniske modifikationer, herunder konstruktionen af en magnetisk baseret optageplatform, der muliggør præcis placering af oocytter og forskellige elektroder, brug af badeopløsningen som leder i spændingsdifferentielle elektroder, vedtagelse af en kommerciel KCl-elektrode med lav lækage som referenceelektrode, fremstilling af strøm- og spændingselektroder fra tyndvæggede glaskapillærer og placering af alle elektroderne ved hjælp af magnetisk baserede enheder. Metoden beskrevet her muliggør praktiske og robuste optagelser af forbindelsesstrøm (Ij) mellem to modsatte Xenopus oocytter.
Introduction
GLI’er er intercellulære kanaler, der kan tillade den aktuelle strøm og udveksling af små cytosoliske molekyler mellem naboceller. De findes i mange celletyper og udfører forskellige fysiologiske funktioner. GJ’er hos hvirveldyr er dannet af connexiner, mens de i hvirvelløse dyr af innexiner. Hver GJ består af to sidestillede hæmikanaler med enten 6 eller 8 underenheder pr. hemikanal, afhængigt af om de er connexiner eller innexiner 1,2,3. Mennesker har 21 connexingener4, mens de almindeligt anvendte hvirvelløse modeller C. elegans og Drosophila melanogaster har henholdsvis 25 og 8 innexingener,henholdsvis 5,6. Alternativ splejsning af gentranskripter kan yderligere øge mangfoldigheden af GJ-proteiner, i det mindste for innexiner 7,8.
GLI’er kan opdeles i tre kategorier baseret på molekylære sammensætninger: homotypisk, heterotypisk og heteromerisk. En homotypisk GJ har alle sine underenheder identiske. En heterotypisk GJ har to homomere hæmikanaler, men de to hæmikanaler dannes af to forskellige GJ-proteiner. En heteromer GJ indeholder mindst en heteromer hemikanal. De molekylære mangfoldigheder af GLI’er kan give forskellige biofysiske egenskaber, der er vigtige for deres fysiologiske funktioner. GJ biofysiske egenskaber moduleres også af regulatoriske proteiner9. For at forstå, hvordan GLI’er udfører deres fysiologiske funktioner, er det vigtigt at kende deres molekylære sammensætninger, biofysiske egenskaber og regulatoriske proteiners roller i deres funktioner.
Heterologe ekspressionssystemer bruges ofte til at studere biofysiske egenskaber af ionkanaler, herunder GLI’er, og virkningerne af regulatoriske proteiner på dem. Fordi heterologe ekspressionssystemer tillader ekspression af specifikke proteiner, er de generelt mere modtagelige for at dissekere proteinfunktioner end indfødte væv, hvor proteiner med overflødige funktioner kan komplicere analysen, og registrering af Ij kan være uopnåelig. Desværre er de mest almindeligt anvendte cellelinjer undtagen Neuro-2A-cellen uhensigtsmæssige til at studere GJ biofysiske egenskaber på grund af komplikationer af endogene connexiner. Selv Neuro-2A-celler er ikke altid egnede til denne form for analyse. For eksempel kunne vi ikke detektere nogen Ij i Neuro-2A-celler transfekteret med innexinerne UNC-7 og UNC-9 i hverken fravær eller tilstedeværelse af UNC-1 (ikke offentliggjort), hvilket er nødvendigt for funktionen af UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. På den anden side er Xenopus oocytter et nyttigt alternativt system til elektrofysiologiske analyser af GJ’er. Selvom de udtrykker et endogent GJ-protein, connexin 38 (Cx38)11, kan potentielle komplikationer let undgås ved at injicere et specifikt antisense-oligonukleotid12. Analyser af GLI’er med Xenopus oocytter kræver imidlertid en differentiel spændingsklemme af to sidestillede celler, hvilket er teknisk udfordrende. De tidligste succeser med dobbeltspændingsklemme af frøblastomerer blev rapporteret for omkring 40 år siden13,14. Siden da har mange undersøgelser brugt denne teknik til at optage Ij i parrede Xenopus oocytter. Imidlertid er stort set alle de tidligere undersøgelser blevet udført med enten hjemmelavede forstærkere 12,15,16 eller kommercielle forstærkere designet til optagelser på enkelte oocytter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Fordi selv de kommercielle forstærkere ikke giver instruktioner til dobbelt oocytspændingsklemme, er det ofte udfordrende for nye eller mindre sofistikerede elektrofysiologiske laboratorier at implementere denne teknik.
Der er kun udviklet én kommerciel forstærker til dobbelt oocytspændingsklemme, OC-725C fra Warner Instruments (Table of Materials, figur 1A). Denne forstærker kan anvendes i enten en standardtilstand (for enkelte oocytter) eller en måletilstand med høj sidestrøm (for enkelte eller dobbelte oocytter) afhængigt af om to stikkontakter i dens spændingssonde er tilsluttet (figur 1B, C). Indtil vores nylige undersøgelse7 havde der imidlertid ikke været en eneste publikation, der beskrev brugen af denne forstærker i dens måletilstand med høj sidestrøm. Selvom forstærkeren er blevet brugt af et andet laboratorium til dobbelt oocytoptagelser, blev den brugt i standarden snarere end den høje sidetilstand21,22. Denne mangel på rapporter, der bruger forstærkeren i sin måletilstand med høj sidestrøm, kan skyldes tekniske vanskeligheder. Vi var ikke i stand til at opnå stabile dobbelte oocytoptagelser ved hjælp af high side-tilstanden ved at følge instruktionerne fra producenten. I årenes løb har vi prøvet tre forskellige tilgange til dobbelt oocytoptagelser, herunder brug af to OC-725C-forstærkere i højsidestrømsmåletilstand, to OC-725C-forstærkere i standardtilstand og to forstærkere fra en anden producent. Til sidst lykkedes det os kun at opnå stabile optagelser med den første tilgang efter omfattende forsøg og fejl. Denne publikation beskriver og demonstrerer de procedurer, vi bruger til at udtrykke GJ-proteiner i Xenopus oocytter, registrere Ij ved hjælp af højsidestrømsmålemodus og analysere de elektrofysiologiske data ved hjælp af populær kommerciel software. Yderligere oplysninger om dobbeltspændingsklemmeteknikken findes i andre publikationer19,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Systemoptimering ser ud til at være nødvendig for eksperimenter med dobbelt oocytspændingsklemme. Uden det kan optagelser være meget ustabile, og forstærkerne skal muligvis injicere en for stor mængde strøm for at nå mål-Vm’en, hvilket resulterer i oocytskader og optagelsesfejl. Flere faktorer er afgørende for at opnå stabile dobbelte oocytoptagelser med målemetoden med høj sidestrøm. For det første skal strøm- og spændingselektrerne have passende modstand (~ 1 MΩ), og deres holdere skal være …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Haiying Zhan, Qian Ge for deres engagement i den indledende fase af den tekniske udvikling, Kiranmayi Vedantham for at hjælpe med tallene og Dr. Camillo Peracchia for råd om oocytparringskammeret.
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).
