जेनोफस Ocytes से रिकॉर्डिंग गैप जंक्शन वर्तमान
Summary
यहां हम ज़ेनोफस ओसाइट में गैप जंक्शन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए वाणिज्यिक एम्पलीफायर का उपयोग करके दो एपोस्ड ओसाइटों के बीच जंक्शनल वर्तमान रिकॉर्ड करते हैं।
Abstract
जेनोफस ओसाइटों में कोनेक्सिन और इनेक्सिन की हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति गैप जंक्शनों (जीजे) के बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। हालांकि, यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इसके लिए एक आम जमीन साझा करने वाले दो विरोधी ओसाइटों के विभेदक वोल्टेज क्लैंप की आवश्यकता होती है। यद्यपि प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या इस तकनीक को करने में सफल रही है, अनिवार्य रूप से उन सभी ने या तो घर का बना एम्पलीफायरों या वाणिज्यिक एम्पलीफायरों का उपयोग किया है जो एकल-ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे। इस तकनीक को लागू करने के लिए अन्य प्रयोगशालाओं के लिए अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। यद्यपि एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड को दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक वाणिज्यिक एम्पलीफायर में शामिल किया गया है, लेकिन हमारे हाल के अध्ययन तक इसके आवेदन के लिए कोई रिपोर्ट नहीं थी। हमने कई तकनीकी संशोधनों को पेश करके उच्च पक्ष वर्तमान मापने के दृष्टिकोण को अधिक व्यावहारिक और सुविधाजनक बना दिया है, जिसमें चुंबकीय रूप से आधारित रिकॉर्डिंग प्लेटफ़ॉर्म का निर्माण शामिल है जो ओसाइट और विभिन्न इलेक्ट्रोड के सटीक प्लेसमेंट की अनुमति देता है, वोल्टेज डिफरेंशियल इलेक्ट्रोड में कंडक्टर के रूप में स्नान समाधान का उपयोग, संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में एक वाणिज्यिक कम रिसाव केसीएल इलेक्ट्रोड को अपनाना, पतली दीवार कांच केशिकाओं से वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड का निर्माण, और चुंबकीय रूप से आधारित उपकरणों का उपयोग करके सभी इलेक्ट्रोड की स्थिति। यहां वर्णित विधि दो विरोधी ज़ेनोफस ओसाइटों के बीच जंक्शनल करंट (आईजे) की सुविधाजनक और मजबूत रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है।
Introduction
जीजे अंतरकोशिकीय चैनल हैं जो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच छोटे साइटोसोलिक अणुओं के वर्तमान प्रवाह और आदान-प्रदान की अनुमति दे सकते हैं। वे कई सेल प्रकारों में मौजूद हैं और विभिन्न शारीरिक कार्यों को करते हैं। कशेरुकियों में जीजे का गठन कनेक्सिन द्वारा किया जाता है, जबकि अकशेरुकी में इननेक्सिन द्वारा। प्रत्येक जीजे में दो जुदा हेमीचैनल होते हैं, जिनमें या तो 6 या 8 सबयूनिट्स प्रति हेमिचैनल होते हैं, यह इस बात पर निर्भर करता है कि वे 1,2,3 मेंकॉनेक्सिन या इननेक्सिन हैं या नहीं। मनुष्यों में 21 कोनेक्सिन जीन4 होते हैं, जबकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अकशेरुकी मॉडल सी एलिगन्स और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में क्रमशः 25 और 8 इननेक्सिन जीन होते हैं, क्रमशः 5,6। जीन टेपों के वैकल्पिक splicing जीजे प्रोटीन की विविधता को और बढ़ा सकता है, कम से कमinnexins 7,8 के लिए।
जीजे को आणविक रचनाओं के आधार पर तीन श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: होमोटाइपिक, हेटरोटाइपिक और हेटरोमेरिक। एक होमोटाइपिक जीजे में इसके सभी सबयूनिट्स समान होते हैं। एक हेटरोटाइपिक जीजे में दो होमोमेरिक हेमिचैनल होते हैं, लेकिन दो हेमिचैनल दो अलग-अलग जीजे प्रोटीन द्वारा बनते हैं। एक हेटेरोमेरिक जीजे में कम से कम एक हेटरोमेरिक हेमिचैनल होता है। जीजे की आणविक विविधताएं अलग-अलग बायोफिजिकल गुण प्रदान कर सकती हैं जो उनके शारीरिक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। जीजे बायोफिजिकल गुणों को भी नियामक प्रोटीन 9 द्वारा संशोधित किया जाताहै। यह समझने के लिए कि जीजे अपने शारीरिक कार्यों को कैसे करते हैं, उनकी आणविक रचनाओं, बायोफिजिकल गुणों और उनके कार्यों में नियामक प्रोटीन की भूमिकाओं को जानना महत्वपूर्ण है।
हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग अक्सर आयन चैनलों के जैव भौतिक गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जिसमें जीजे भी शामिल हैं, और उन पर नियामक प्रोटीन के प्रभाव। क्योंकि हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियां विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं, वे आम तौर पर मूल ऊतकों की तुलना में प्रोटीन कार्यों को विच्छेदित करने के लिए अधिक उपयुक्त होते हैं जहां अनावश्यक कार्यों वाले प्रोटीन विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं, और आईजे की रिकॉर्डिंग अप्राप्य हो सकती है। दुर्भाग्य से, न्यूरो -2 ए सेल को छोड़कर सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें अंतर्जात connexins द्वारा जटिलताओं के कारण जीजे बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। यहां तक कि न्यूरो -2 ए कोशिकाएं भी इस तरह के विश्लेषण के लिए हमेशा उपयुक्त नहीं होती हैं। उदाहरण के लिए, हम न्यूरो -2 ए कोशिकाओं में किसी भी आईजे का पता नहीं लगा सकते हैं जो यूएनसी -7 और यूएनसी -9 के साथ संक्रमित है, या तो अनुपस्थिति या यूएनसी -1 (अप्रकाशित) की उपस्थिति में, जो सी एलिगेंस 9,10 में यूएनसी –9 जीजे के कार्य के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, ज़ेनोफस ओसाइट जीजे के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक उपयोगी वैकल्पिक प्रणाली है। यद्यपि वे एक अंतर्जात जीजे प्रोटीन, connexin 38 (Cx38)11 व्यक्त करते हैं, संभावित जटिलताओं को एक विशिष्ट एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड12 को इंजेक्ट करके आसानी से टाला जा सकता है। हालांकि, ज़ेनोफस ओसाइटों के साथ जीजे के विश्लेषण के लिए दो जुदा कोशिकाओं के विभेदक वोल्टेज क्लैंप की आवश्यकता होती है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। मेंढक ब्लास्टोमेयर के डबल वोल्टेज क्लैंप की शुरुआती सफलताओं को लगभग 40 साल पहले13,14 साल पहले रिपोर्ट किया गया था। तब से, कई अध्ययनों ने इस तकनीक का उपयोग युग्मित ज़ेनोपस ओसाइटों में आईजे को रिकॉर्ड करने के लिए किया है। हालांकि, अनिवार्य रूप से पिछले सभी अध्ययनों को या तो घर का बना एम्पलीफायरों 12,15,16 या एकल ओसाइटों (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, या AxoClamp 2B, अक्षतंतु उपकरण, यूनियन सिटी, सीए) 8,17,18,19,20 पर रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए वाणिज्यिक एम्पलीफायरों के साथ किया गया है। . क्योंकि यहां तक कि वाणिज्यिक एम्पलीफायर भी डबल ओसाइट वोल्टेज क्लैंप के लिए निर्देश प्रदान नहीं करते हैं, इसलिए इस तकनीक को लागू करने के लिए नए या कम परिष्कृत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगशालाओं के लिए अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है।
डबल ओसाइट वोल्टेज क्लैंप के लिए केवल एक वाणिज्यिक एम्पलीफायर विकसित किया गया है, वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स से ओसी -725 सी (सामग्री की तालिका, चित्रा 1 ए)। इस एम्पलीफायर का उपयोग या तो एक मानक मोड (एकल ओसाइट के लिए) या एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड (एकल या दोहरे ओसाइटों के लिए) में किया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि इसकी वोल्टेज जांच में दो सॉकेट जुड़े हुए हैं या नहीं (चित्रा 1 बी, सी)। हालांकि, हमारे हाल के अध्ययन7 तक, इसके उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में इस एम्पलीफायर के उपयोग का वर्णन करने वाला एक भी प्रकाशन नहीं था। हालांकि एम्पलीफायर का उपयोग दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए एक अन्य प्रयोगशाला द्वारा किया गया है, इसका उपयोग उच्च पक्ष मोड21,22 के बजाय मानक में किया गया था। अपने उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में एम्पलीफायर का उपयोग कर रिपोर्ट की यह कमी तकनीकी कठिनाइयों के कारण हो सकती है। हम निर्माता से निर्देशों का पालन करके उच्च पक्ष मोड का उपयोग करके स्थिर दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में असमर्थ थे। इन वर्षों में, हमने दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों की कोशिश की है, जिसमें उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में दो ओसी -725 सी एम्पलीफायरों, मानक मोड में दो ओसी -725 सी एम्पलीफायरों और किसी अन्य निर्माता से दो एम्पलीफायरों का उपयोग करना शामिल है। हम अंततः व्यापक परीक्षण और त्रुटि के बाद केवल पहले दृष्टिकोण के साथ स्थिर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में सफल रहे। यह प्रकाशन उन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है और प्रदर्शित करता है जिनका उपयोग हम ज़ेनोफस ओसाइट्स में जीजे प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए करते हैं, रिकॉर्ड मैं उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड का उपयोग करके जे करता हूं, और लोकप्रिय वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा का विश्लेषण करता हूं। डबल वोल्टेज-क्लैंप तकनीक के बारे में अतिरिक्त जानकारी अन्य प्रकाशनों19,23 में पाई जा सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सिस्टम अनुकूलन दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप प्रयोगों के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। इसके बिना, रिकॉर्डिंग अत्यधिक अस्थिर हो सकती है, और एम्पलीफायरों को लक्ष्य वीएम तक पहुंचने के लिए अत्यधिक मात्रा में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी विकास के प्रारंभिक चरण में उनकी भागीदारी के लिए हैयिंग झान, कियान जीई, आंकड़ों के साथ मदद करने के लिए किरणमयी वेदांथम, और ओसाइट पेयरिंग चैंबर पर सलाह के लिए डॉ कैमिलो पेराचिया को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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