Anvendelser af RNA-interferens i amerikansk kakerlak
Summary
Den nuværende protokol beskriver trinvise retningslinjer for RNAi-operationsteknikkerne i P. americana.
Abstract
Kakerlakker, et sanitært skadedyr, er vigtige arter i insektudviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser på grund af deres lette fodring og hemimetaboløse egenskaber. Alt i alt med velkommenterede genomsekvenser har disse fordele gjort amerikansk kakerlak, Periplaneta americana, til en vigtig hemimetaboløs insektmodel. Begrænset af manglen på knockout-strategi bliver effektiv RNA-interferens (RNAi)-baseret gennedslag en uundværlig teknik i funktionel genforskning af P. americana. Den nuværende protokol beskriver RNAi-operationsteknikkerne i P. americana. Protokollen omfatter (1) udvælgelse af P. americana på korrekte udviklingsstadier, (2) forberedelse til injektionsindstillingen, (3) dsRNA-injektion og (4) påvisning af gennedslagseffektivitet. RNAi er et kraftfuldt omvendt genetisk værktøj i P. americana. Størstedelen af P. americana-væv er følsomme over for ekstracellulært dsRNA. Dens enkelhed gør det muligt for forskere hurtigt at opnå dysfunktionelle fænotyper under en eller flere målrettede dsRNA-injektioner, hvilket gør det muligt for forskere bedre at bruge P. americana til udviklingsmæssige og metamorfe undersøgelser.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolutionært bevaret mekanisme, bliver gradvist et vigtigt omvendt genetisk værktøj til at hæmme genekspression i mange organismer1, da Andrew Fire og Craig Mello2 udviklede den dobbeltstrengede RNA (dsRNA) medierede gensindsigtsstrategi. dsRNA spaltes i fragmenter af 21-23 nukleotider, små interfererende RNA’er (siRNA’er), af enzymet Dicer i celler for at aktivere RNAi-vejen. Derefter inkorporeres siRNA’er i det RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC), som kobles til mål-mRNA’et, forårsager mRNA-spaltning og resulterer til sidst i tab af genfunktion 3,4,5. Blandt insektarterne er mange systemiske RNAi-eksperimenter hidtil blevet rapporteret i masser af insektordrer, såsom Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera og Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlakker (Blattaria) er en essentiel insektfamilie i udviklingsmæssige og metamorfe studier med deres hurtige vækstcyklusser, stærke tilpasningsevne til miljøet og høj udviklingsmæssig plasticitet9. Før man opdagede, at RNAi var kompatibel med kakerlakker, fokuserede tidligere forskning kun på kakerlakforebyggelse og -kontrol på grund af mangel på genetiske manipulationsteknikker i kakerlakker. Kakerlak oothecas unikke struktur gjorde det udfordrende at udføre embryoinjektionsbaseret genknockout med CRISPR-Cas9-systemet. Desuden viser de fleste væv i kakerlakker (såsom P. americana) robust systemisk RNAi-respons, hvilket muliggør hurtig generering af dysfunktionelle fænotyper ved at injicere en eller flere målrettede dsRNA’er 9,10,11. Disse funktioner gjorde RNAi til en uundværlig teknik inden for genfunktionel forskning i P. americana.
Selvom brugen af RNAi i funktionel genforskning i P. americana er blevet rapporteret, var der ingen detaljeret eller trinvis beskrivelse tilgængelig. Denne rapport giver en trinvis operationel retningslinje for RNAi i P. americana, der er nyttig til genfunktionsundersøgelse i andre kakerlakker. Desuden er denne vejledning ikke begrænset til Blattodea og kan anvendes på mange andre insekter med mindre ændringer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne rapport beskrev en metodologisk trin-for-trin RNAi-strategi i P. americana; Bemærk, at det også kan anvendes på andre kakerlakker (f.eks. Blattella germanica ) og mange andre insekter med mindre ændringer. RNAi’s genhæmningseffektivitet er imidlertid ikke altid høj nok, med en åbenlys ulempe sammenlignet med genknockout-strategien13. Følgende restvirkning af genniveau kan forstyrre de reelle fænotyper. For at sikre, at RNAi-behandlingen er vellykket, skal flere væ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 og 31572325 til C.R., Sh.L.), af Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 og 2020A1515011267 til C.R.), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangdong-provinsen (Grant Nos. 2019B090905003 og 2019A0102006), af Institut for Videnskab og Teknologi i Guangzhou (Grant No. 202102020110), af Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 til Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
