アメリカのゴキブリにおけるRNA干渉の応用
Summary
本プロトコルは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術のための段階的なガイドラインを記載する。
Abstract
衛生害虫であるゴキブリは、その容易な摂食および半代謝特性のために、昆虫の発生および変成研究において必須種である。注釈付きのゲノム配列とともに、これらの利点により、アメリカのゴキブリ、 ペリプラネタアメリカーナ は重要な半代謝昆虫モデルとなっています。ノックアウト戦略の不足によって制限され、効果的なRNA干渉(RNAi)ベースの遺伝子ノックダウンは 、P. americanaの機能的遺伝子研究において不可欠な技術となっている。本プロトコールは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術を記述する。このプロトコルには、(1)適切な発生段階での P.アメリカーナ の選択、(2)注射設定の準備、(3)dsRNA注射、および(4)遺伝子ノックダウン効率検出が含まれる。RNAiは、 P. americanaの強力な逆遺伝学的ツールです。 P. americana 組織の大部分は、細胞外dsRNAに感受性である。そのシンプルさにより、研究者は1回または複数の標的dsRNA注射で機能不全の表現型を迅速に取得でき、研究者は P. americana を発生および変成研究に有効に使用することができます。
Introduction
進化的に保存されたメカニズムであるRNA干渉(RNAi)は、アンドリュー・ファイアとクレイグ・メロ2が二本鎖RNA(dsRNA)媒介遺伝子沈黙戦略を開発して以来、多くの生物1で遺伝子発現を阻害するために徐々に不可欠な逆遺伝学的ツールになります。dsRNAは、21〜23ヌクレオチドの断片に切断され、小さな干渉RNA(siRNA)は、細胞内の酵素ダイサーによってRNAi経路を活性化する。その後、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、標的mRNAに結合し、mRNA切断を引き起こし、最終的に遺伝子機能の喪失をもたらす3、4、5。昆虫種のうち、直翅目、錬翅目、半翅目、鞘翅目、神経翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、およびブラットデア5、6、7、8など、多くの昆虫順でこれまでに多くの全身RNAi実験が報告されている。
ゴキブリ(Blattaria)は、急速な成長サイクル、環境への強い適応性、および高い発生可塑性を備えた発生および変成研究において不可欠な昆虫科である9。RNAiがゴキブリと互換性があることを発見する前は、以前の研究はゴキブリの遺伝子操作技術の不足のためにゴキブリの予防と制御にのみ焦点を当てていました。ゴキブリのオテカのユニークな構造は、CRISPR-Cas9システムで胚注入ベースの遺伝子ノックアウトを行うことを困難にしました。その上、ゴキブリのほとんどの組織(P. americanaなど)は、堅牢な全身RNAi応答を示し、1つ以上の標的dsRNAを注射することによって機能不全表現型の迅速な生成を可能にする9、10、11。これらの特徴により、RNAiはP. americanaの遺伝子機能研究に不可欠な技術となりました。
P. americanaの機能的遺伝子研究におけるRNAiの使用が報告されているにもかかわらず、詳細または段階的な説明は得られなかった。このレポートは、P. americanaのRNAiの段階的な運用ガイドラインを提供し、他のゴキブリの遺伝子機能研究に有用である。さらに、このガイドはBlattodeaに限定されず、軽微な変更を加えて他の多くの昆虫に適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この報告書は、 P. americanaにおける方法論的ステップバイステップRNAi戦略を説明した。注目すべきは、他のゴキブリ(例えば、Blattella germanica )や、小さな変化を伴う他の多くの昆虫にも適用することができる。しかし、RNAiの遺伝子サイレンシング効率は必ずしも十分に高いとは限らず、遺伝子ノックアウト戦略と比較して明らかな欠点がある13。遺伝子レベルの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号32070500、31620103917、31330072、および31572325からC.R.、Sh.L.まで)、広東省自然科学財団(助成金番号2021B1515020044および2020A1515011267からC.R.まで)、広東省科学技術部(助成金番号2019B090905003および2019A0102006)、広州科学技術部(助成金番号202102020110)の支援を受けました。 深セン科学技術プログラム(助成金番号。KQTD20180411143628272からSh.L.へ)。
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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