Toepassingen van RNA-interferentie in Amerikaanse kakkerlak
Summary
Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze richtlijnen voor de RNAi-operatietechnieken in P. americana.
Abstract
Kakkerlakken, een sanitaire plaag, zijn essentiële soorten in insectenontwikkelings- en metamorfe studies vanwege hun gemakkelijke voeding en hemimetaboleuze kenmerken. Al met goed geannoteerde genoomsequenties hebben deze voordelen de Amerikaanse kakkerlak Periplaneta americana tot een belangrijk hemimetabolous insectenmodel gemaakt. Beperkt door het tekort aan knock-outstrategie, wordt effectieve RNA-interferentie (RNAi) -gebaseerde gen knockdown een onmisbare techniek in functioneel genonderzoek van P. americana. Het huidige protocol beschrijft de RNAi-operatietechnieken in P. americana. Het protocol omvat (1) selectie van de P. americana in de juiste ontwikkelingsstadia, (2) voorbereiding op de injectie-instelling, (3) dsRNA-injectie en (4) detectie van gen knockdown-efficiëntie. RNAi is een krachtig omgekeerd genetisch hulpmiddel in P. americana. De meerderheid van de P. americana weefsels zijn gevoelig voor extracellulair dsRNA. De eenvoud stelt onderzoekers in staat om snel disfunctionele fenotypes te verkrijgen onder een of meerdere gerichte dsRNA-injecties, waardoor onderzoekers de P. americana beter kunnen gebruiken voor ontwikkelings- en metamorfe studies.
Introduction
RNA-interferentie (RNAi), een evolutionair geconserveerd mechanisme, wordt geleidelijk een essentieel omgekeerd genetisch hulpmiddel om genexpressie in veel organismen te remmen1, sinds Andrew Fire en Craig Mello2 de dubbelstrengs RNA (dsRNA) gemedieerde genstilte strategie ontwikkelden. dsRNA wordt door het enzym Dicer in cellen gesplitst in fragmenten van 21-23 nucleotiden, kleine interfererende RNA’s (siRNA’s), om de RNAi-route te activeren. Vervolgens worden siRNA’s opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC), dat koppelt aan het doelmRNA, mRNA-splitsing veroorzaakt en uiteindelijk resulteert in het verlies van genfunctie 3,4,5. Onder de insectensoorten zijn tot nu toe veel systemische RNAi-experimenten gemeld in veel insectenorden, zoals Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera en Blattodea 5,6,7,8.
Kakkerlakken (Blattaria) zijn een essentiële insectenfamilie in ontwikkelings- en metamorfe studies met hun snelle groeicycli, sterk aanpassingsvermogen aan de omgeving en hoge ontwikkelingsplasticiteit9. Voordat werd ontdekt dat RNAi compatibel was met kakkerlakken, richtte eerder onderzoek zich alleen op kakkerlakkenpreventie en -bestrijding vanwege een schaarste aan genetische manipulatietechnieken bij kakkerlakken. De unieke structuur van de kakkerlak ootheca maakte het een uitdaging om op embryo-injectie gebaseerde gen knock-out uit te voeren met het CRISPR-Cas9-systeem. Bovendien vertonen de meeste weefsels in kakkerlakken (zoals P. americana) een robuuste systemische RNAi-respons, waardoor de snelle generatie van disfunctionele fenotypen mogelijk is door een of meer gerichte dsRNA’s 9,10,11 te injecteren. Deze eigenschappen maakten RNAi tot een onmisbare techniek in genfunctioneel onderzoek bij P. americana.
Hoewel het gebruik van RNAi in functioneel genonderzoek bij P. americana is gemeld, was er geen gedetailleerde of stapsgewijze beschrijving beschikbaar. Dit rapport biedt een stapsgewijze operationele richtlijn voor RNAi in P. americana, nuttig voor genfunctiestudie bij andere kakkerlakken. Bovendien is deze gids niet beperkt tot Blattodea en kan deze met kleine aanpassingen op veel andere insecten worden toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit rapport beschreef een methodologische stap-voor-stap RNAi-strategie in P. americana; van belang, het kan ook worden toegepast op andere kakkerlakken (Blattella germanica, bijvoorbeeld) en vele andere insecten met kleine veranderingen. De gen-uitschakelingsefficiëntie van RNAi is echter niet altijd hoog genoeg, met een duidelijk nadeel ten opzichte van de gen knock-out strategie13. Het volgende residuele effect van genniveau kan interfereren met de echte fenotypen. Om ervoor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072, and 31572325 to C.R., Sh.L.), by the Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 and 2020A1515011267 to C.R.), by the Department of Science and Technology in Guangdong Province (Grant Nos. 2019B090905003 and 2019A0102006), by the Department of Science and Technology in Guangzhou (Grant No. 202102020110), door het Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 naar Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
