Summary
본 프로토콜은 P. americana에서 RNAi 조작 기술에 대한 단계별 지침을 설명합니다.
Abstract
위생 해충 인 바퀴벌레는 쉬운 먹이와 반대사 적 특성으로 인해 곤충 발달 및 변형 연구에서 필수적인 종입니다. 주석이 잘 달린 게놈 서열과 함께, 이러한 장점은 미국 바퀴벌레 인 Periplaneta americana를 중요한 반대사 곤충 모델로 만들었습니다. 녹아웃 전략의 부족으로 제한되는 효과적인 RNA 간섭 (RNAi) 기반 유전자 녹다운은 P. americana의 기능적 유전자 연구에 없어서는 안될 기술이됩니다. 본 프로토콜은 P. americana에서의 RNAi 조작 기술을 기술한다. 프로토콜은 (1) 적절한 발달 단계에서 P. americana 의 선택, (2) 주사 설정을위한 준비, (3) dsRNA 주사, 및 (4) 유전자 녹다운 효율 검출을 포함한다. RNAi는 P. americana의 강력한 역 유전 도구입니다. P. americana 조직의 대부분은 세포외 dsRNA에 민감하다. 그것의 단순성은 연구자가 하나 또는 여러 개의 표적화 dsRNA 주사 하에서 기능 장애 표현형을 신속하게 얻을 수있게하여 연구자가 발달 및 변형 연구에 P. americana를 더 잘 사용할 수있게 해줍니다.
Introduction
진화적으로 보존된 기전인 RNA 간섭(RNAi)은 앤드류 파이어(Andrew Fire)와 크레이그 멜로 2(Craig Mello2)가 이중 가닥 RNA(dsRNA) 매개 유전자 침묵 전략을 개발했기 때문에 점차 많은 유기체1에서 유전자 발현을 억제하는 필수적인 역유전학적 도구가 된다. dsRNA는 21-23 뉴클레오티드의 단편으로 절단되고, 작은 간섭 RNA (siRNAs)는, 세포 내의 다이서 효소에 의해 RNAi 경로를 활성화시킨다. 그런 다음 siRNA가 표적 mRNA에 결합하고 mRNA 절단을 일으키고, 최종적으로 유전자 기능 3,4,5의 손실을 초래하는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)에 혼입된다. 곤충 종 중에서, 많은 전신 RNAi 실험은 지금까지 Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera 및 Blattodea 5,6,7,8과 같은 많은 곤충 순서에서보고되었습니다.
바퀴벌레 (Blattaria)는 급속한 성장주기, 환경에 대한 강한 적응력 및 높은 발달 가소성으로 발달 및 변형 연구에서 필수적인 곤충 군입니다9. RNAi가 바퀴벌레와 호환된다는 것을 발견하기 전에 이전 연구는 바퀴벌레의 유전자 조작 기술이 부족하기 때문에 바퀴벌레 예방 및 통제에만 중점을 두었습니다. 바퀴벌레 오테카의 독특한 구조는 CRISPR-Cas9 시스템으로 배아 주입 기반 유전자 녹아웃을 수행하는 것을 어렵게 만들었습니다. 게다가, 바퀴벌레의 대부분의 조직 (예 : P. americana)은 강력한 전신 RNAi 반응을 보여 하나 이상의 표적화 dsRNAs 9,10,11을 주입하여 기능 장애 표현형을 신속하게 생성 할 수 있습니다. 이러한 특징은 RNAi를 P. americana의 유전자 기능 연구에서 없어서는 안될 기술로 만들었습니다.
P. americana의 기능적 유전자 연구에서 RNAi의 사용이보고되었지만 상세하거나 단계별 설명은 제공되지 않았습니다. 이 보고서는 다른 바퀴벌레의 유전자 기능 연구에 유용한 P. americana의 RNAi에 대한 단계별 운영 지침을 제공합니다. 또한,이 가이드는 Blattodea에 국한되지 않으며 사소한 수정으로 다른 많은 곤충에 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
P. americana의 라인은 처음에 Huiling Hao 박사에 의해 제공되었습니다. 이 종은 30 년 동안 근친 교배로 유지되어왔습니다 9.
1. P. americana의 부화 및 먹이주기
- P. americana의 신선한 oothecae (알을 낳는 직후)를 수집하고 ~ 25 일 동안 25 °C 및 60 % 습도의 어두운 인큐베이터에서 배양하십시오. 그런 다음 부화 3 일 전에 온도와 습도를 30 ° C와 75 %로 높입니다.
- 4mm 조리개가있는 체를 사용하여 부화 한 님프를 oothecae에서 분리하십시오.
- 님프를 원통형 용기 (직경 12cm, 높이 10cm)에 28 °C, 70 % 습도의 어둠 속에 보관하십시오. 바퀴벌레가 탈출하는 것을 막기 위해 바셀린으로 용기의 안쪽 가장자리를 닦으십시오. 쥐 음식, 물 및 피난처 (달걀 쟁반)를 제공하십시오. 님프의 활동에주의를 기울이고 정기적으로 대변과 파편을 청소하십시오.
2. 적절한 별에서 님프의 선택
- 유리 튜브를 사용하여 갓 털갈이 된 P. americana (몸 색깔이 흰색)를 골라냅니다. 새 용기에 보관하고 올바른 치료 단계를 기다리십시오.
참고 : 위의 수유 조건 하에서 ~ 19 일 후, 3번째 별의 님프는 주사를 사용할 수 있습니다. 갓 털갈이 한 바퀴벌레의 색깔은 흰색이며, 별은 털갈이 시간에 의해 명확 해집니다.
3. T7 프로모터를 이용한 표적 단편의 제조
- P. americana의 cDNA를 주형으로 사용하여, PCR을 수행하여 짝을 이룬 프라이머를 설계하여 표적 유전자9의 300-800 bp DNA 단편을 얻었다. 그런 다음 PCR 단편을 시퀀싱을 위해 pTOPO 벡터 (물질 표 참조)에 클로닝하십시오.
- 표적 단편 DNA를 주형으로 사용하여, 5' 말단에서 T7 프로모터 서열 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTCACTATAGG-3')을 갖는 하나의 새로운 프라이머 쌍을 합성하고, PCR의 또 다른 라운드를 수행하여 각 측면9에 T7 프로모터를 갖는 표적 단편을 얻었다.
4. 시험관 내에서 dsRNA의 전사 및 합성
- 10 μL의 T7 2X 버퍼, 2 μL의 효소 믹스, 2 μL의 T7 Express (표 표 참조) 및 2 μg의 PCR 생성물 (단계 3.2에서 수득됨)을 반응 시스템에 첨가하고, ddH2O로 총 부피를20μL로 첨가하고, 수동으로 거꾸로 부드럽게 혼합하고, 37°C에서 30분 동안 및 70°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 그런 다음 천천히 실온으로 식히십시오.
- RNase A 용액 (4 μg / μL)을 ddH2 O로 1:200의 비율로 희석하십시오. 그런 다음 RQ1 RNase-Free DNase (1 U / μL) 1 μL와 희석 된 RNase A 용액 1 μL를 시스템에 첨가하십시오 (자료 표 참조).
참고: 이제 단일 시스템의 부피는 22μL입니다. - 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 아세트산나트륨의 총 부피의 10%(N 반응을 동시에 수행할 때, 총 부피는 N x 22 μL임)와 이소프로판올의 총 부피의 세 부피를 첨가한다.
- 수동으로 거꾸로 부드럽게 혼합하고, 얼음 위에 5분 동안 놓고, 4°C에서 10분 동안 13,000 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 피펫으로 제거하고, 잔류물을 75% 에탄올(25% 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 물 사용)으로 세척한 다음, 4°C에서 5분 동안 13,000 x g 에서 원심분리한다.
- 상층액을 다시 제거하십시오. 펠렛을 실온에서 15분 동안 공기-건조시켰다. ~100μL의 DEPC 물을 사용하여 dsRNA를 용해시킨 다음, dsRNA를 최종 2μg/μL로 희석한다.
참고: dsRNA는 -80°C에서 6개월 동안 저장될 수 있었다.
5. dsRNA 용액을 주사기에 로딩
- 각 주입의 부피가 일관되게 유지되도록 미리 마이크로 주입 펌프 ( 재료 표 참조)에 프로그램을 설정하십시오. 주사기를 사용하기 전에 주사기를 DEPC 물로 8-10 번 채워 주사기를 청소하십시오.
- 10 μL 주사기를 미세주입 펌프에 설치하고, 펌프를 시작하고, 주사기를 10 μL의 dsRNA 용액으로 채운다(단계 4.6에서 제조). dsRNA 1 μL를 3번째 인스타 님프에 주입하고(단계 2 참조) 체내로 누출되지 않도록 합니다.
6. P. 아메리카나에 dsRNA를 주입
- 바퀴벌레가 더 이상 움직이지 않을 때까지 용기에CO2 농도가 증가하여 바퀴벌레를 마취 한 다음 즉시 주사를 진행하십시오.
- 핀셋으로 바퀴벌레를 부드럽게 집어 들고 바퀴벌레를 손으로 바늘 쪽으로 배달하십시오. 다음으로, 표피에 대해 수평으로 두 개의 복부 소마이트 사이의 틈을 통해 바늘을 삽입하십시오. 삽입 깊이에 관해서는 얕을수록 좋습니다.
- 그런 다음 dsRNA 용액을 바퀴벌레에 주입하십시오. 마지막으로, 바늘 끝을 당깁니다. 내부 장기의 손상을 피하기 위해 바늘 끝이 표피에 가능한 한 가까이 있는지 확인하십시오.
참고 : 주사는 해부 현미경으로 이루어져야합니다. - 주입 된 바퀴벌레를 깨끗한 생물 분석 용기에 넣으십시오. 이들이 CO2 효과로부터 회복되도록 하기 위해 약10-20 분 동안 기다린다. 용기에 주사 날짜, dsRNA의 종류 및 복용량, P. americana의 나이로 라벨을 붙입니다.
- 주입 된 바퀴벌레를 28 ° C, 70 % 습도의 어두운 환경에 놓고 물, 사료 및 피난처를 제공하고 바퀴벌레의 표현형의 가능한 변화를 정기적으로 관찰하십시오.
7. 녹다운 확인 및 표현형 분석
- 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 웨스턴 블롯팅과 같은 임의의 이용가능한 분자 생물학 기술을 사용하여 RNAi의 효율을 평가한다. 자세한 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅 절차는 참조1,12를 참조하십시오.
- RNAi 관련 표현형을 관찰하고 분석하려면 살아있는 동물에 적합한 현미경을 사용하십시오.
참고 : RNAi는 바퀴벌레의 형태, 행동, 탈피, 사지 재생 및 기타 생리 활동에 영향을 줄 수 있습니다. 표현형의 특정 빈도는 특정 조건에 따라 계산됩니다.
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Representative Results
그림 1은 성공적인 주사를 보여줍니다. 마이크로 직경 바늘이 있는 미세주사 주사기는 부스터 위에 수평으로 놓아야 합니다(그림 1A). 바늘은 표피에 대해 수평으로 두 복부 소마이트 사이의 틈을 통해 삽입됩니다 (그림 1B). 액체가 P. americana 복부에 들어가는지 확인하십시오. 바늘의 너무 가파른 각도는 내부 장기를 손상시키고 (그림 1C), 부적절한 주사는 복부 밖으로 dsRNA 용액이 누출됩니다 (그림 1D). dsRNA가 새어 나오면 동물을 버려야하며 또 다른 주사가 수행됩니다. P. americana는 주사 중에 완전히 마취해야합니다.
다른 생물학적 실험과 마찬가지로, RNAi 치료가 수행될 때 대조군이 필요하다. 치료 차이는 dsRNA의 오프 타겟 효과, 주사 동안의 손상, 또는CO2 마취로 인한 것이 아니라 표적화된 RNAi에 의해 야기됨을 확인할 필요가 있다. 여기에 Ddc(Dopa decarboxylase) 및 Dpp(decapentaplegic) 유전자는 dsRNA 주입 후 털갈이 바퀴벌레의 표현형을 관찰하기 위해 2가지 예로 선정하였으며, 동물에서 표적이 없는 음성 대조군 dsMock11을, 음성 대조군으로 수행하였고, RNAi 효율을 qRT-PCR로 검출하였다(도 2). ds Ddc의 주사를 예로 들자면(도 3A,B), 녹다운된Ddc 유전자 를 갖는 P. americana는 멜라닌화가 차단된 이후 오랜 시간 동안 백색 표피를 가질 것이다(도 3B). 사지 재생에 필요한 dsDpp 주사의 실험에서, RNAi는 사지 재생을 방해했으며(그림 4), 이는 이전에9번 보고되었다.
그림 1: 기기 및 올바른 주입 작동 . (A) 미세 주입 장비의 주사기. (b) 주사 바늘의 정확한 위치; 액체가 나오지 않습니다. (c) 주사 바늘의 너무 가파른 각도는 내부 장기를 손상시킬 수 있습니다. (d) 주사 실패는 dsRNA 용액 또는 용혈림프가 유출되는 결과를 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: qRT-PCR에 의해 검출된 RNAi 효율. Ddc 및 Dpp 유전자의 녹다운 효율은 qRT-PCR에 의해 검출되었고, dsMock은 음성 대조군으로 사용되었다. 각 처리에 대해 세 번의 반복실험이 사용되었고, 오차 막대는 세 번의 반복실험의 표준 편차를 나타낸다. 차이의 중요성은 스튜던트 t-검정에 의해 분석되었다. *: P< 0.05, **: P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : P. americana에서 표피 멜라닌화의 파괴에 대한 성공적인 RNAi의 예. (A) 정상적인 멜라닌화와dsMock의 주사 후 정상 바퀴벌레. (B) Ddc RNAi 매개 백색증 P. americana 탈피 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: P. americana에서 사지 재생의 중단에 대한 성공적인 RNAi의 예. (A) 절단된 뒷다리를 가진 P. americana. (B-C) P. americana는 RNAi 치료 및 탈피 후. 뒷다리는 dsMock 대조군 (B)에서 재생되었지만 Dpp (C) 유전자가 침묵되었을 때는 재생되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서는 P. americana의 방법론적 단계별 RNAi 전략을 기술하였다; 참고로, 그것은 또한 다른 바퀴벌레 (예 : Blattella germanica )와 사소한 변화가있는 다른 많은 곤충에도 적용될 수 있습니다. 그러나, RNAi의 유전자 침묵 효율이 항상 충분히 높은 것은 아니며, 유전자 녹아웃 전략(13)과 비교하여 명백한 단점이 있다. 유전자 수준의 다음의 잔류 효과는 실제 표현형을 방해할 수 있다. RNAi 치료가 성공적인지 확인하기 위해서는 동물의 물리적 상태, 대조군의 선택, dsRNA 분자의 길이 및 농도, 오프 타겟 효과 (OTE)의 가능성 회피 및 dsRNA에 대한 조직의 다른 민감도를 포함하여 몇 가지 필수 조건을 고려해야합니다.
P. 아메리카나의 신체 상태
건강한 동물은 RNAi 및 P. americana의 다양한 유전자 기능 연구의 성공을위한 전제입니다. 게다가 실험을 일관되게 유지하기 위해 동일한 조건에서 자란 바퀴벌레 만 선택됩니다. 그리고 3번째 instar (부화 후 약 19 일)보다 오래된 님프 만 사용할 수 있습니다.왜냐하면 어린 님프는 신체 크기에 주사하기에는 너무 작기 때문입니다.
대조군 선택
dsMock11 및 dsEGFP 및 동일한 용량의 바퀴벌레 식염수6이 음성 대조군으로 사용되었다. 음성 대조군의 표적 서열은 외인성이어야 하며 내인성 유전자 서열11과 상동성이 없어야 한다. dsEGFP를 사용하면 P. americana의 성장 및 발달이 어느 정도 지연될 수 있기 때문에 dsMock이 선호되었다.
dsRNA 길이
RNAi의 효율은 dsRNA 분자의 길이에 의해 영향을 받는다. 더 긴 dsRNA 단편은 mRNA 침묵에 더 효과적이며, 아마도 더 많은 siRNA를 생산하기 때문에, 또는 더 짧은 dsRNA 단편이 세포에 의해 덜 효율적으로 흡수되기 때문이다 1. P. americana 및 B. germanica에서, 300 bp 내지 800 bp 사이의 dsRNA는 RNAi 실험 6,9,10,14에 이상적으로 나타난다. 짧은 dsRNA는 전신 RNAi 반응을 유도하기에 불충분할 수 있는 반면, 긴 dsRNA는 OTE 위험1을 증가시킬 수 있다.
dsRNA 농도
dsRNA의 농도는 또한 RNAi1,15의 효율에 영향을 미칠 수 있다. P. americana의 3번째 인스타 님프의 경우, 1 μg의 dsRNA가 합리적인 양으로 보이며, 4-6 μg은 성인 6,9,14,16에 적합합니다. 주사에 사용되는 정확한 dsRNA 양은 P. americana의 유전자, 조직 및 신체 크기에 기초하여 조정될 수 있다.
오프 타겟 효과
RNAi의 OTE는17,18을 모두 피하기 어렵습니다. dsRNA의 두 개의 겹치지 않는 영역은 표현형5에 대한 OTE의 효과를 감소시키도록 설계될 수 있다. 두 개의 별개의 영역을 표적화하는 dsRNA가 동일한 효과를 생성한다면, OTE 유도된 위양성 현상의 가능성은 배제될 수 있다.
RNAi 효율 검출을 위한 방법
표현형 분석은 RNAi를 평가하기 위한 가장 직관적인 접근 방식이며, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯팅 분석은 녹다운 효율을 측정하기 위한 두 가지 황금 표준입니다. qRT-PCR은 mRNA 레벨 6,9,10에서 간섭 효율을 결정하는 간단한 방법입니다. 프라이머는 dsRNA 표적화 영역으로부터 설계되어야 한다. 웨스턴 블롯팅 분석은 단백질 수준의 간섭을 분석하는 또 다른 방법이지만 특정 항체가 필요합니다. 그러나 높은 침묵 효율 (>90 %)에서도 특정 표현형 효과는 때때로 관찰되지 않습니다. 이 잔류 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 바퀴벌레의 대규모 유전자 패밀리 확장입니다. 유전자의 중복은 많은 특정 기능과 표현형을 제어합니다. 또 다른 가능한 설명은 기능적으로 충분히 요구되는 최소 유전자 발현 수준이 극히 낮다는 것이다. 이들은 충분히 높은 RNAi 효율을 갖는 경우에도 특정 표현형을 얻는 데 실패를 초래한다.
RNAi 민감성에 대한 조직 특이성
일부 바퀴벌레 조직 (예 : 난소 및 부속 땀샘)의 간섭 효율은 dsRNA 5,19의 침투 장벽이 될 수있는 충분히 높지 않습니다. 상이한 곤충 종에서 상이한 RNAi 효능이 또한 관찰되며, 이는 용혈림프15,20에서 dsRNA의 효소적 분해에 의존한다. 몇 가지 아이디어는 시험관내21에서 dsRNA를 siRNA로 소화하고, dsRNA 용량 및 주입 시간을 증가시키고, 전달을 위한 담체로서 나노물질을 사용하는 것과 같은 P. americana 조직에서 RNAi 효율을 향상시키는 데 합리적이다.
결론적으로, RNAi의 높은 효율과 잘 주석이 달린 게놈 서열9 는 P. americana를 광범위한 발달, 생리 및 행동 연구에서 유전자 기능을 조사하기위한 좋은 모델로 만듭니다. 마찬가지로,이 보고서는 dsRNA에 민감하고 녹아웃 돌연변이를 만들기 어려운 다른 곤충에 대한 귀중한 참고 자료가 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 32070500, 31620103917, 31330072 및 31572325 C.R., Sh.L.), 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2021B1515020044 및 2020A1515011267 ~ C.R.), 광동성 과학 기술부 (보조금 번호 2019B090905003 및 2019A0102006), 광저우 과학 기술부 (보조금 번호 202102020110), 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272 to Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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