Tillämpningar av RNA-interferens i amerikansk kackerlacka
Summary
Detta protokoll beskriver steg-för-steg-riktlinjer för RNAi-operationsteknikerna i P. americana.
Abstract
Kackerlackor, ett sanitärt skadedjur, är viktiga arter i insektsutvecklings- och metamorfa studier på grund av deras enkla utfodring och hemimetabola egenskaper. Sammantaget med väl kommenterade genomsekvenser har dessa fördelar gjort amerikansk kackerlacka, Periplaneta americana, till en viktig hemimetabol insektsmodell. Begränsad av bristen på knockout-strategi blir effektiv RNA-interferens (RNAi) -baserad genknockdown en oumbärlig teknik i funktionell genforskning av P. americana. Föreliggande protokoll beskriver RNAi-operationsteknikerna i P. americana. Protokollet innefattar (1) val av P. americana vid lämpliga utvecklingsstadier, (2) förberedelse för injektionsinställningen, (3) dsRNA-injektion och (4) detektering av gennedslagningseffektivitet. RNAi är ett kraftfullt omvänd genetiskt verktyg i P. americana. Majoriteten av P. americana vävnader är känsliga för extracellulärt dsRNA. Dess enkelhet gör det möjligt för forskare att snabbt få dysfunktionella fenotyper under en eller flera riktade dsRNA-injektioner, vilket gör det möjligt för forskare att bättre använda P. americana för utvecklings- och metamorfa studier.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolutionärt bevarad mekanism, blir gradvis ett viktigt omvänd genetiskt verktyg för att hämma genuttryck i många organismer1, eftersom Andrew Fire och Craig Mello2 utvecklade den dubbelsträngade RNA (dsRNA) medierade gentystningsstrategin. dsRNA klyvs i fragment av 21-23 nukleotider, små interfererande RNA (siRNA), av enzymet Dicer i celler för att aktivera RNAi-vägen. Därefter införlivas siRNA i det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC), som kopplas till mål-mRNA, orsakar mRNA-klyvning och slutligen resulterar i förlust av genfunktion 3,4,5. Bland insektsarterna har många systemiska RNAi-experiment hittills rapporterats i många insektsordningar, såsom Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera och Blattodea 5,6,7,8.
Kackerlackor (Blattaria) är en viktig insektsfamilj i utvecklings- och metamorfa studier med sina snabba tillväxtcykler, starka anpassningsförmåga till miljön och hög utvecklingsplasticitet9. Innan man upptäckte att RNAi var kompatibel med kackerlackor, fokuserade tidigare forskning endast på förebyggande och kontroll av kackerlacka på grund av brist på genetiska manipulationstekniker i kackerlackor. Kackerlackan oothecas unika struktur gjorde det utmanande att utföra embryoinjektionsbaserad genknockout med CRISPR-Cas9-systemet. Dessutom visar de flesta vävnader i kackerlackor (såsom P. americana) robust systemiskt RNAi-svar, vilket möjliggör snabb generering av dysfunktionella fenotyper genom att injicera en eller flera riktade dsRNA 9,10,11. Dessa egenskaper gjorde RNAi till en oumbärlig teknik inom genfunktionell forskning i P. americana.
Även om användningen av RNAi i funktionell genforskning i P. americana har rapporterats, var ingen detaljerad eller steg-för-steg-beskrivning tillgänglig. Denna rapport ger en steg-för-steg operativ riktlinje för RNAi i P. americana, användbar för genfunktionsstudie i andra kackerlackor. Dessutom är denna guide inte begränsad till Blattodea och kan tillämpas på många andra insekter med mindre modifieringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna rapport beskrev en metodologisk steg-för-steg-RNAi-strategi i P. americana; Observera att det också kan appliceras på andra kackerlackor (till exempel Blattella germanica ) och många andra insekter med mindre förändringar. RNAi: s gendämpningseffektivitet är emellertid inte alltid tillräckligt hög, med en uppenbar nackdel jämfört med genknockoutstrategin13. Följande kvarvarande effekt av gennivå kan störa de verkliga fenotyperna. För att säkerställa att RN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 och 31572325 till C.R., Sh.L.), av Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 and 2020A15111267 to C.R.), av Department of Science and Technology i Guangdongprovinsen (Grant Nos. 2019B090905003 and 2019A0102006), av Department of Science and Technology i Guangzhou (Grant No. 202102020110), av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 till Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
