Anwendungen der RNA-Interferenz in amerikanischen Kakerlaken
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Richtlinien für die RNAi-Operationstechniken in P. americana.
Abstract
Kakerlaken, ein Hygieneschädling, sind aufgrund ihrer einfachen Fütterung und ihrer hemimetabolen Eigenschaften essentielle Arten in Insektenentwicklungs- und metamorphen Studien. Insgesamt haben diese Vorteile mit gut annotierten Genomsequenzen die amerikanische Kakerlake Periplaneta americana zu einem wichtigen hemimetabolen Insektenmodell gemacht. Begrenzt durch den Mangel an Knockout-Strategie wird effektiver RNA-Interferenz (RNAi)-basierter Gen-Knockdown zu einer unverzichtbaren Technik in der funktionellen Genforschung von P. americana. Das vorliegende Protokoll beschreibt die RNAi-Operationstechniken in P. americana. Das Protokoll umfasst (1) die Auswahl des P. americana in den richtigen Entwicklungsstadien, (2) die Vorbereitung auf die Injektionseinstellung, (3) die dsRNA-Injektion und (4) die Erkennung der Gen-Knockdown-Effizienz. RNAi ist ein mächtiges umgekehrtes genetisches Werkzeug in P. americana. Die Mehrheit der P. americana-Gewebe ist empfindlich gegenüber extrazellulärer dsRNA. Seine Einfachheit ermöglicht es Forschern, schnell dysfunktionale Phänotypen unter einer oder mehreren gezielten dsRNA-Injektionen zu erhalten, so dass Forscher das P. americana besser für Entwicklungs- und metamorphe Studien verwenden können.
Introduction
RNA-Interferenz (RNAi), ein evolutionär konservierter Mechanismus, wird allmählich zu einem essentiellen reverse-genetischen Werkzeug, um die Genexpression in vielen Organismen zu hemmen1, seit Andrew Fire und Craig Mello2 die doppelsträngige RNA (dsRNA) vermittelte Genstillestrategie entwickelt haben. dsRNA wird durch das Enzym Dicer in Zellen in Fragmente von 21-23 Nukleotiden, kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), gespalten, um den RNAi-Signalweg zu aktivieren. Dann werden siRNAs in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, der an die Ziel-mRNA koppelt, eine mRNA-Spaltung verursacht und schließlich zum Verlust der Genfunktion 3,4,5 führt. Unter den Insektenarten wurden bisher viele systemische RNAi-Experimente in vielen Insektenordnungen berichtet, wie Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera und Blattodea 5,6,7,8.
Kakerlaken (Blattaria) sind eine essentielle Insektenfamilie in Entwicklungs- und metamorphen Studien mit ihren schnellen Wachstumszyklen, ihrer starken Anpassungsfähigkeit an die Umwelt und ihrer hohen Entwicklungsplastizität9. Bevor entdeckt wurde, dass RNAi mit Kakerlaken kompatibel war, konzentrierte sich die bisherige Forschung nur auf die Prävention und Kontrolle von Kakerlaken aufgrund einer Knappheit genetischer Manipulationstechniken bei Kakerlaken. Die einzigartige Struktur der Kakerlaken-Oothek machte es schwierig, einen auf Embryoneninjektionen basierenden Gen-Knockout mit dem CRISPR-Cas9-System durchzuführen. Außerdem zeigen die meisten Gewebe in Kakerlaken (wie P. americana) eine robuste systemische RNAi-Reaktion, die die schnelle Erzeugung dysfunktionaler Phänotypen durch Injektion einer oder mehrerer Ziel-dsRNAs 9,10,11 ermöglicht. Diese Eigenschaften machten RNAi zu einer unverzichtbaren Technik in der Genfunktionsforschung bei P. americana.
Obwohl über die Verwendung von RNAi in der funktionellen Genforschung in P. americana berichtet wurde, war keine detaillierte oder Schritt-für-Schritt-Beschreibung verfügbar. Dieser Bericht enthält eine Schritt-für-Schritt-Betriebsleitlinie für RNAi in P. americana, die für die Genfunktionsstudie bei anderen Kakerlaken nützlich ist. Darüber hinaus ist dieser Leitfaden nicht auf Blattodea beschränkt und kann mit geringfügigen Modifikationen auf viele andere Insekten angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschrieb eine methodische Schritt-für-Schritt-RNAi-Strategie in P. americana; Bemerkenswert ist, dass es auch auf andere Kakerlaken (Blattella germanica, zum Beispiel) und viele andere Insekten mit geringfügigen Veränderungen angewendet werden kann. Die Gen-Silencing-Effizienz von RNAi ist jedoch nicht immer hoch genug, mit einem offensichtlichen Nachteil gegenüber der Gen-Knockout-Strategie13. Der folgende Resteffekt der Genebene kann die realen Phänotypen s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 und 31572325 to C.R., Sh.L.), von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 und 2020A1515011267 to C.R.), vom Department of Science and Technology in Guangdong Province (Grant Nos. 2019B090905003 und 2019A0102006), vom Department of Science and Technology in Guangzhou (Grant No. 202102020110), durch das Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 bis Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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