用于高内涵筛选和分析应用的大规模生产球体的稳健方法
Summary
该协议详细介绍了生产三种不同类型的球体的方法，使其适用于大规模高内涵筛选和分析。此外，还提供了示例，展示了如何在球体和单个细胞水平上分析它们。
Abstract
高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是使研究人员能够从细胞中提取大规模定量表型测量的技术。这种方法已被证明对于加深我们对细胞生物学中广泛的基本和应用事件的理解是强大的。迄今为止，该技术的大多数应用都依赖于使用单层生长的细胞，尽管人们越来越意识到这些模型并不能概括组织中发生的许多相互作用和过程。因此，在开发和使用3维（3D）细胞组件（例如球体和类器官）方面出现了。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究的背景下特别强大，但它们以适用于HCS和HCA的可重复方式进行生产和分析，带来了许多挑战。这里详述的方案描述了一种产生多细胞肿瘤球体（MCTS）的方法，并证明它可以以与HCS和HCA兼容的方式应用于三种不同的细胞系。该方法有助于每孔产生数百个球体，提供了特定的优点，即当用于筛选制度时，可以从每孔数百个结构中获得数据，所有这些都以相同的方式处理。还提供了示例，其中详细介绍了如何处理球体以进行高分辨率荧光成像，以及HCA如何在球体水平以及从每个球体内的单个细胞中提取定量特征。该协议可以很容易地应用于回答细胞生物学中的各种重要问题。
Introduction
传统上，基于细胞的测定是在固体底物上生长的单层中进行的，这实际上可以被认为是二维（2D）环境。然而，人们越来越认识到，2D细胞培养模型在某些情况下缺乏生理相关性，无法复制细胞之间发生的许多复杂相互作用1。三维（3D）细胞培养方法在研究人员中迅速流行，3D细胞模型显示出更好地模拟细胞在组织环境中遇到的生理条件的巨大潜力2。已经使用了几种不同类型的3D细胞组件，但最常见的两种类型是球体和类器官。球状体可以从许多不同的细胞系中生长，它们可以根据所使用的细胞类型及其组装方法采用各种形状和大小3。此外，当球状体从癌细胞系生长时，它们也可以被称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这些模型已经发现特别适用于临床前 体外 药物递送和毒性研究4，5。另一方面，类器官旨在更好地模仿我们体内的组织和器官，并且可以采用更复杂的形态安排。类器官的产生涉及使用成体干细胞或多能干细胞，它们可以重新编程到适当的细胞中以类似于感兴趣的组织或器官。它们主要用于研究器官的发育，并对疾病和宿主-病原体相互作用进行建模6。
有一系列不同的方法可用于生成 3D 单元组件。基于支架的方法提供了一种底物或支撑物，细胞可以附着或生长在其内。这些脚手架可以有各种形状，可以由各种不同的材料制成。最常见的是细胞外基质（ECM）成分和水凝胶，它们被设计成类似于细胞的天然细胞外环境，从而促进生理相互作用4，7。ECM基底材料已从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤肿瘤中提取，并显示含有丰富的ECM成分混合物，包括层粘连蛋白，IV型胶原蛋白和perlecan8。然而，尽管其成分有利，但其使用存在两个主要挑战，即其批次间变异性，以及它在10°C8，9以下和上方具有两种不同的聚集状态。相比之下，水凝胶在组件和刚度方面具有柔韧性的优势，并且可以定制以适应所需的特定3D细胞组件7，10。基于支架的方法对于类器官生长至关重要，但也广泛用于球体。无支架方法通过防止细胞附着在它们生长的表面上起作用，通常只与球体组装兼容。例子包括超低附着（ULA）板，具有平底或U形底，允许细胞聚集成球状体，或使用旋转瓶中细胞的连续搅拌10。
使用3D细胞组件来研究各种生物事件正在迅速普及;然而，为他们的养殖选择的方法必须适当，并且与下游分析计划兼容。例如，使用ULA板可产生高稠度的球体;然而，这种方法仅限于生产每孔的单个球体，从而限制了通量。在计划对3D结构进行荧光成像时，需要特别考虑。生长组件的基板或板需要具有光学相容性，并且必须注意将可能使用的任何支架引起的光散射的影响降至最低11。随着显微镜物镜的数值孔径增加，这一特殊问题变得更加尖锐。
可以说，选择使用3D细胞模型的主要原因之一是提取不仅关于整个组件的体积成像数据，还提取其中单个细胞的体积成像数据。特别是MCTS模型，对于加深我们对治疗药物如何从外部传递到中心细胞（就像它们在肿瘤中需要的那样）的理解方面开始变得非常强大12，因此从不同层的单个细胞中获得知识至关重要。从单个细胞中提取定量信息的成像技术被称为高内涵分析（HCA），是筛选环境中的一种强大方法13。迄今为止，HCA几乎只应用于单层培养物，但人们越来越意识到这种方法具有应用于3D培养物的能力，从而能够研究广泛的细胞功能和过程14。它具有明显的优势，可以分析大量的3D组件，从而可能从每个结构中提供单元级数据。然而，需要克服与潜在厚细胞组件的成像以及生成的大型数据集相关的挑战。
本文介绍了一种基于支架的稳健方法，用于大规模生产96孔格式的MCTS。该方法有助于在每个孔中生产数百个3D单元组件。显示了三种不同细胞类型的示例，代表肝脏，肺和结肠的实体瘤模型。形成的球体可以是各种大小，因此HCA用于选择特定大小和/或形态的结构。这一特征提供了额外的优势，即观察到的任何表型都可以在不同大小的球体之间进行比较，但在同一孔中以相同的方式处理。这种方法与高分辨率成像兼容，重要的是提供来自相同细胞组件的细胞水平和亚细胞水平的定量数据。与每孔产生单个球体的方法相比，这种球体生产方法具有额外的优势，即每个孔中产生的大量球体可能为其他下游分析（如转录组和蛋白质组分析）提供足够的生物量。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方法详细介绍了一个平台，该平台以适合HCS和HCA的方式每孔产生数百个球体。与其他流行的方法相比，例如使用平底和圆底ULA板，这些板允许每个孔仅形成一个旋转椭球体18，19，这种方法为以筛选格式从大量球体中提取高分辨率信息提供了机会。值得注意的是，这种方法已经在3种不同的细胞系中得到证明，代表了各种肿瘤类型，突出了它对…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认爱尔兰科学基金会（SFI）（16 / RI / 3745）对JCS的基础设施研究资助的支持。ucd细胞筛选实验室的工作由ucd科学学院支持。ASC由爱尔兰研究委员会（IRC）爱尔兰政府研究生奖学金（GOIPG / 2019 / 68）资助。作者还感谢实验室所有成员的投入和有益的讨论。图 1 中的图稿是在 BioRender 中生成的。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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