ハイコンテンツスクリーニングおよび分析アプリケーションのためのスフェロイドの大規模生産のための堅牢な方法
Summary
このプロトコルは、大規模なハイコンテンツスクリーニングおよび分析に適した方法で3つの異なるタイプのスフェロイドを製造する方法を詳述する。さらに、回転楕円体および個々の細胞レベルでそれらをどのように分析できるかを示す例を提示する。
Abstract
ハイコンテントスクリーニング(HCS)およびハイコンテント分析(HCA)は、研究者が細胞から大規模な定量的表現型測定値を抽出する能力を提供する技術です。このアプローチは、細胞生物学における基本的な事象と応用事象の両方の幅広い理解を深めるのに強力であることが証明されています。今日まで、この技術の用途の大部分は単層で増殖した細胞の使用に依存してきましたが、そのようなモデルは組織で起こる相互作用やプロセスの多くを再現しないことがますます認識されています。そのため、スフェロイドやオルガノイドなどの3次元(3D)細胞アセンブリの開発と使用に出現しています。これらの3Dモデルは、がん生物学および薬物送達研究の文脈において特に強力であるが、HCSおよびHCAに適した再現可能な方法でのそれらの産生および解析は、多くの課題を提示する。ここで詳述するプロトコールは、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)の生成のための方法を記載し、HCSおよびHCAと適合性のある様式で3つの異なる細胞株に適用できることを実証する。この方法は、ウェル当たり数百個のスフェロイドの産生を容易にし、スクリーニングレジームにおいて使用される場合、ウェル当たり数百個の構造からデータを得ることができ、全て同一の方法で処理され得るという特定の利点を提供する。また、高解像度蛍光イメージングのためにスフェロイドを処理する方法や、HCAがスフェロイドレベルと各スフェロイド内の個々の細胞の両方から定量的特徴を抽出する方法を詳述する例も提供されています。このプロトコルは、細胞生物学における幅広い重要な質問に答えるために容易に適用することができます。
Introduction
伝統的に、細胞ベースのアッセイは、固体基質上に成長する単層において行われており、これは効果的に2次元(2D)環境と考えることができる。しかし、2D細胞培養モデルは、いくつかの文脈では生理学的関連性を欠いており、細胞間で起こる複雑な相互作用の多くを再現できないことがますます認識されつつあります1。3次元(3D)細胞培養法は研究者の間で急速に普及しており、3D細胞モデルは、組織環境内の細胞が遭遇する生理学的条件をよりよく模倣する高い可能性を示しています2。採用されている3Dセルアセンブリにはいくつかの異なるタイプがありますが、最も一般的な2つのタイプは回転楕円体とオルガノイドです。スフェロイドは、多くの異なる細胞株から増殖させることができ、使用する細胞型およびそれらの組み立て方法に応じて様々な形状およびサイズを採用することができる3。さらに、スフェロイドは、癌細胞株から増殖させる場合、多細胞腫瘍スフェロイド(MCTS)と呼ばれることもあり、これらのモデルは、前臨床のインビトロ薬物送達および毒性研究に特に使用されることを見出している4,5。一方、オルガノイドは、私たちの体の組織や臓器をよりよく模倣することを目指しており、より複雑な形態学的配置を採用することができます。オルガノイドの産生は、成体幹細胞または多能性幹細胞の使用を含み、これは、目的の組織または器官に類似するように適切な細胞に再プログラムされ得る。これらは主に臓器の発達を調査し、疾患や宿主と病原体の相互作用をモデル化するために使用されます6。
3Dセルアセンブリを生成するために使用されるさまざまな方法があります。足場ベースの方法は、細胞が内部で付着または増殖することができる基質または支持体を提供する。これらの足場は、様々な形状を有することができ、様々な異なる材料から作製することができる。最も一般的なのは細胞外マトリックス(ECM)成分とヒドロゲルであり、それらは細胞の自然な細胞外環境に似せ、それによって生理学的相互作用を促進するように設計されています4,7。ECM地下材料は、エンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫腫瘍から抽出され、ラミニン、IV型コラーゲン、およびペルレカン8を含むECM成分の豊富な混合物を含有することが示された。しかしながら、その有利な組成にもかかわらず、その使用には2つの主な課題、すなわちそのバッチ間の変動性および10°C以下および10°C以上の2つの異なる凝集状態を有する8,9がある。対照的に、ヒドロゲルは、その成分および剛性に関して柔軟であるという利点を有し、そしてそれらは、所望の特定の3D細胞集合体に合うようにカスタマイズすることができる7,10。足場ベースの方法は、オルガノイドの成長に不可欠であるが、回転楕円体にも広く使用されている。足場のない方法は、細胞が成長している表面に細胞が付着するのを防ぐことによって機能しますが、通常は回転楕円体アセンブリとのみ互換性があります。例としては、細胞をスフェロイドに凝集させる平底またはU底のいずれかを備えた超低接着(ULA)プレート、またはスピナー/回転フラスコ内の細胞の連続攪拌の使用が含まれます10。
多種多様な生物学的事象を研究するための3D細胞アセンブリの使用は、急速に人気を集めています。しかし、彼らの培養のために選択された方法が適切であり、下流分析の計画と互換性があることが不可欠です。例えば、ULAプレートを使用すると、高い一貫性の回転楕円体が生成されます。しかし、この方法はウェルあたり単一の回転楕円体の生産に制限されているため、スループットが制限されます。3D構造の蛍光イメージングが計画される際には、特に考慮が必要である。アセンブリが成長させる基板またはプレートは光学的に互換性がある必要があり、使用された可能性のある足場によって引き起こされる光散乱の影響を最小限に抑えるように注意する必要があります11。この特定の問題は、顕微鏡対物レンズの開口数が増加するにつれてより深刻になる。
おそらく、3D細胞モデルを使用することを選んだ主な理由の1つは、アセンブリ全体だけでなく、その中の個々のセルに関する体積イメージングデータを抽出することです。特にMCTSモデルは、治療薬が外部から中枢細胞にどのように移行するか(腫瘍内で必要なように)12の理解を深めるために非常に強力であることが証明され始めているため、異なる層の個々の細胞から知識を得ることが不可欠です。個々の細胞から定量的情報を抽出するイメージング技術は、ハイコンテンツ分析(HCA)と呼ばれ、スクリーニングの文脈において強力なアプローチです13。今日まで、HCAはほぼ独占的に単層培養に適用されてきましたが、このアプローチは幅広い細胞機能とプロセスを研究できる3D培養に適用する力を持っているという認識が高まっています14。多数の3Dアセンブリを解析でき、各構造全体からセルレベルのデータを提供できるという明確な利点があります。しかし、潜在的に厚い細胞集合体のイメージングに関連する課題、および生成される大規模なデータセットは、克服する必要があります。
この記事では、96ウェルフォーマットのMCTSの大規模生産のための堅牢な足場ベースの方法を紹介します。この方法は、各ウェルにおける数百の3D細胞集合体の製造を容易にする。3つの異なる細胞型について例を示し、肝臓、肺、および結腸の固形腫瘍モデルを表す。形成される回転楕円体は様々なサイズであり得るので、HCAは特定のサイズおよび/または形態の構造を選択するために使用される。この特徴は、観察された表現型を異なるサイズの回転楕円体間で比較することができるが、すべて同じウェル内で同じ方法で処理されるという追加の利点を提供する。このアプローチは高解像度イメージングと互換性があり、重要なことに、同じ細胞集合体から細胞レベルと細胞下レベルの両方の定量データを提供します。このスフェロイド生産方法は、ウェルごとに単一のスフェロイドを生成する方法よりもさらに利点があり、各ウェルで生産される多数のスフェロイドは、トランスクリプトームやプロテオームプロファイリングなどの他の下流分析に十分なバイオマスを提供する可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するアプローチは、HCSおよびHCAに適した方法でウェルあたり数百の回転楕円体を生成するためのプラットフォームを詳述する。ウェルあたり1つの回転楕円体のみの形成を可能にする平底および丸底ULAプレートの使用など、他の一般的な方法と比較して18,19、この方法は、スクリーニング形式で多数の回転楕円体から高解像度情報を抽出?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、アイルランド科学財団(SFI)(16/RI/3745)からJCSへのインフラ研究助成金の支援を認めている。UCD細胞スクリーニング研究所での研究は、UCD科学大学によって支援されています。ASCは、アイルランド研究評議会(IRC)のアイルランド政府大学院奨学金(GOIPG/2019/68)から資金提供を受けています。著者らはまた、ラボのすべてのメンバーの意見と有益な議論に感謝します。図 1 のアートワークは、BioRender で生成されたものです。
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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