고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법
Summary
이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.
Abstract
고함량 스크리닝 (HCS) 및 고함량 분석 (HCA)은 연구자들에게 세포에서 대규모 정량적 표현형 측정을 추출 할 수있는 능력을 제공하는 기술입니다. 이 접근법은 세포 생물학에서 근본적인 사건과 적용된 사건의 광범위한 범위에 대한 우리의 이해를 깊게하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 현재까지이 기술에 대한 대부분의 응용 프로그램은 단층에서 자란 세포의 사용에 의존해 왔지만 그러한 모델이 조직에서 발생하는 많은 상호 작용 및 과정을 재검토하지 않는다는 것이 점점 더 실현되고 있습니다. 이와 같이, 구상체 및 오가노이드와 같은 3차원(3D) 세포 어셈블리의 개발 및 사용에 있어서 출현이 있었다. 이러한 3D 모델은 암 생물학 및 약물 전달 연구의 맥락에서 특히 강력하지만, HCS 및 HCA에 적합한 재현 가능한 방식으로 생산 및 분석하는 것은 많은 도전 과제를 제시합니다. 여기에 상술된 프로토콜은 다세포 종양 구상체(MCTS)의 생성을 위한 방법을 설명하고, HCS 및 HCA와 양립가능한 방식으로 세 개의 상이한 세포주에 적용될 수 있음을 입증한다. 이 방법은 웰 당 수백 개의 구상체의 생산을 용이하게하며, 스크리닝 정권에서 사용될 때 웰 당 수백 개의 구조물로부터 데이터를 얻을 수 있으며 모두 동일한 방식으로 처리 할 수 있다는 특별한 이점을 제공합니다. 고분해능 형광 이미징을 위해 구상체를 처리하는 방법과 HCA가 각 스페로이드 내의 개별 세포뿐만 아니라 스페로이드 수준에서 정량적 특징을 추출하는 방법을 자세히 설명하는 예도 제공됩니다. 이 프로토콜은 세포 생물학에서 중요한 질문의 넓은 범위에 대답하기 위해 쉽게 적용될 수 있습니다.
Introduction
전통적으로, 세포-기반 분석은 고체 기질 상에서 성장하는 단층에서 수행되었으며, 이는 효과적으로 2차원(2D) 환경으로서 고려될 수 있다. 그러나, 2D 세포 배양 모델은 일부 맥락에서 생리학적 관련성이 결여되어 세포들 사이에서 발생하는 많은 복잡한 상호작용을 복제할 수 없다는 것이 점점 더 인식되고 있다1. 3차원(3D) 세포 배양 방법은 연구자들 사이에서 빠르게 인기를 얻고 있으며, 3D 세포 모델은 조직 환경에서 세포가 직면하는 생리적 조건을 더 잘 모방할 수 있는 높은 잠재력을 보여준다2. 사용 된 3D 셀 어셈블리에는 여러 가지 유형이 있지만 가장 일반적인 두 가지 유형은 구상체와 오가노이드입니다. 구상체는 다양한 세포주에서 성장할 수 있으며, 사용되는 세포 유형과 조립 방법에 따라 다양한 모양과 크기를 채택 할 수 있습니다3. 더욱이, 구상체는 또한 이들이 암 세포주로부터 성장할 때 다세포 종양 구상체 (MCTS)로 지칭될 수 있으며, 이들 모델은 전임상 시험관내 약물 전달 및 독성 연구에 특히 사용되는 것을 발견하였다4,5. 반면에 오가노이드는 우리 몸의 조직과 장기를보다 잘 모방하는 것을 목표로하며보다 복잡한 형태 학적 배열을 채택 할 수 있습니다. 오가노이드의 생산은 성체 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포의 사용을 포함하며, 이는 관심있는 조직 또는 기관과 유사한 적절한 세포로 재 프로그래밍 될 수 있습니다. 그들은 주로 장기의 발달을 조사하고 질병 및 숙주 – 병원체 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다6.
3D 셀 어셈블리를 생성하는 데 사용되는 다양한 방법이 있습니다. 스캐폴드-기반 방법은 세포가 부착되거나 성장할 수 있는 기질 또는 지지체를 제공한다. 이러한 스캐폴드는 다양한 형상을 가질 수 있으며 다양한 상이한 재료로 만들어질 수 있다. 가장 흔한 것은 세포외 매트릭스 (ECM) 성분과 하이드로젤이며, 이들은 세포의 자연적인 세포외 환경과 유사하도록 설계되어 생리적 상호작용을 촉진한다4,7. ECM basement 물질은 Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 종양으로부터 추출되었으며, 라미닌, IV형 콜라겐 및 펄레칸8을 포함하는 ECM 성분의 풍부한 혼합물을 함유하는 것으로 나타났다. 그러나, 그것의 유리한 구성에도 불구하고, 그것의 사용에는 두 가지 주요 과제, 즉 배치 대 배치 가변성과 10 °C8,9 이하와 그 이상의 두 가지 다른 응집체 상태를 갖는다는 것이 있습니다. 대조적으로, 하이드로젤은 그 성분 및 강성에 대하여 유연하다는 장점이 있으며, 이들은 원하는 특정 3D 셀 어셈블리에 적합하도록 맞춤화될 수 있다7,10. 스캐폴드 기반 방법은 오가노이드 성장에 필수적이지만 구상체에도 널리 사용됩니다. 세포가 자라는 표면에 부착되는 것을 방지하여 작동하는 스캐폴드가없는 방법은 일반적으로 스페로이드 어셈블리와 만 호환됩니다. 예를 들어 세포를 구상체로 응집시킬 수 있는 평평한 바닥 또는 U-바닥을 갖는 초저 부착(ULA) 플레이트 또는 스피너/회전 플라스크에서 세포의 지속적인 교반 사용10이 포함됩니다.
다양한 생물학적 사건을 연구하기 위해 3D 세포 어셈블리를 사용하는 것이 빠르게 인기를 얻고 있습니다. 그러나 그들의 문화를 위해 선택된 방법이 적절하고 다운 스트림 분석 계획과 양립 할 수 있어야합니다. 예를 들어, ULA 플레이트의 사용은 높은 일관성의 구상체를 생성한다; 그러나, 이 방법은 웰 당 단일 스페로이드의 생산으로 제한되고, 따라서 처리량을 제한한다. 3D 구조물의 형광 이미징이 계획될 때 특별한 고려가 필요하다. 조립체가 성장되는 기판 또는 플레이트는 광학적으로 호환될 필요가 있으며, 사용되었을 수 있는 임의의 스캐폴드에 의해 야기되는 광산란의 영향을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 한다11. 이 특별한 문제는 현미경 대물 렌즈의 개구수가 증가함에 따라 더욱 심각해진다.
아마도 3D 세포 모델로 작업하기 위해 선택하는 주요 이유 중 하나는 전체 어셈블리뿐만 아니라 그 안에있는 개별 세포에 대한 체적 이미징 데이터를 추출하는 것입니다. 특히 MCTS 모델은 치료제가 외부에서 중앙 세포로 어떻게 전달되는지에 대한 우리의 이해를 심화시키는 데 매우 강력하다는 것을 증명하기 시작했습니다 (종양에서 필요하기 때문에)12, 따라서 다른 층의 개별 세포로부터 지식을 얻는 것이 필수적입니다. 개별 세포로부터 정량적 정보를 추출하는 이미징 기술은 고함량 분석(HCA)이라고 불리며 스크리닝13의 맥락에서 강력한 접근 방식입니다. 현재까지 HCA는 거의 독점적으로 단층 배양에 적용되어 왔지만,이 접근법이 광범위한 세포 기능 및 과정을 연구 할 수있게 해주는 3D 배양에 적용 할 수있는 힘을 가지고 있다는 인식이 증가하고 있습니다14. 많은 수의 3D 어셈블리를 분석하여 각 구조에서 셀 수준 데이터를 제공 할 수 있다는 분명한 이점이 있습니다. 그러나 잠재적으로 두꺼운 셀 어셈블리의 이미징과 관련된 문제 및 생성 된 대규모 데이터 세트는 극복해야합니다.
이 기사에서는 96-웰 포맷으로 MCTS를 대규모로 생산하기 위한 강력한 스캐폴드 기반 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 웰에서 수백 개의 3D 셀 어셈블리를 쉽게 생산할 수 있습니다. 실시예는 간, 폐 및 결장의 고형 종양 모델을 나타내는 세 가지 상이한 세포 유형에 대해 제시된다. 형성되는 구상체는 다양한 크기일 수 있으며, 따라서 HCA는 특정 크기 및/또는 형태학의 구조를 선택하는데 사용된다. 이 기능은 관찰 된 모든 표현형이 다른 크기의 구상체에 걸쳐 비교 될 수 있지만 모두 동일한 웰에서 동일한 방식으로 처리 될 수 있다는 추가적인 이점을 제공합니다. 이 접근법은 고해상도 이미징과 호환되며, 중요한 것은 동일한 셀룰러 어셈블리에서 세포 수준 및 하위 세포 수준의 정량적 데이터를 모두 제공하는 것입니다. 스페로이드 생산의 이러한 방법은 웰 당 단일 스페로이드를 생성하는 방법에 비해 추가적인 이점을 가지며, 각 웰에서 생산된 많은 수의 스페로이드가 전사체 및 프로테옴 프로파일링과 같은 다른 다운스트림 분석을 위해 잠재적으로 충분한 바이오매스를 제공한다는 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 접근법은 HCS 및 HCA에 적합한 방식으로 웰당 수백 개의 구상체를 생성하기 위한 플랫폼을 상세히 설명한다. 웰 당 하나의 스페로이드 형성 만 허용하는 평평한 바닥 및 둥근 바닥 ULA 플레이트의 사용과 같은 다른 인기있는 방법과 비교할 때,18,19,이 방법은 스크리닝 형식으로 많은 수의 구상체로부터 고해상도 정보를 추출 할 수있는 기회?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 Science Foundation Ireland (SFI) (16 / RI / 3745)에서 JCS에 대한 인프라 연구 보조금의 지원을 인정합니다. UCD 세포 스크리닝 실험실에서의 작업은 UCD 과학 대학의 지원을 받습니다. ASC는 아일랜드 연구위원회 (IRC) 아일랜드 대학원 장학금 (GOIPG / 2019 / 68)의 정부에서 자금을 지원합니다. 저자는 또한 실험실의 모든 구성원에게 그들의 의견과 도움이되는 토론에 감사드립니다. 그림 1의 아트웍은 BioRender에서 생성되었습니다.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
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