Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.
Abstract
High-content screening (HCS) en high-content analysis (HCA) zijn technologieën die onderzoekers de mogelijkheid bieden om grootschalige kwantitatieve fenotypische metingen uit cellen te extraheren. Deze aanpak is krachtig gebleken voor het verdiepen van ons begrip van een breed scala aan zowel fundamentele als toegepaste gebeurtenissen in de celbiologie. Tot op heden zijn de meeste toepassingen voor deze technologie gebaseerd op het gebruik van cellen die in monolagen zijn gekweekt, hoewel men zich steeds meer realiseert dat dergelijke modellen veel van de interacties en processen die in weefsels plaatsvinden niet samenvatten. Als zodanig is er een opkomst in de ontwikkeling en het gebruik van 3-dimensionale (3D) celassemblages, zoals sferoïden en organoïden. Hoewel deze 3D-modellen bijzonder krachtig zijn in de context van kankerbiologie en medicijnafgiftestudies, vormen hun productie en analyse op een reproduceerbare manier die geschikt is voor HCS en HCA een aantal uitdagingen. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een methode voor het genereren van meercellige tumorsferoïden (MCTS) en toont aan dat het kan worden toegepast op drie verschillende cellijnen op een manier die compatibel is met HCS en HCA. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden sferoïden per put, wat het specifieke voordeel biedt dat bij gebruik in een screeningsregime gegevens kunnen worden verkregen uit enkele honderden structuren per put, allemaal op dezelfde manier behandeld. Er worden ook voorbeelden gegeven, die gedetailleerd beschrijven hoe de sferoïden moeten worden verwerkt voor fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie en hoe HCA kwantitatieve kenmerken kan extraheren op zowel het sferoïdeniveau als uit individuele cellen in elke sferoïde. Dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast om een breed scala aan belangrijke vragen in de celbiologie te beantwoorden.
Introduction
Traditioneel worden celgebaseerde assays uitgevoerd in monolagen die groeien op een vast substraat, dat effectief kan worden beschouwd als een tweedimensionale (2D) omgeving. Het wordt echter steeds meer erkend dat 2D-celkweekmodellen in sommige contexten fysiologische relevantie missen en veel van de complexe interacties die tussen cellen optreden niet kunnen repliceren1. Driedimensionale (3D) celkweekmethoden worden snel populair onder onderzoekers en 3D-celmodellen tonen een hoog potentieel om de fysiologische omstandigheden die cellen in de weefselomgeving tegenkomen beter na te bootsen2. Er zijn verschillende soorten 3D-celassemblages die zijn gebruikt, maar de twee meest voorkomende typen zijn sferoïden en organoïden. Sferoïden kunnen uit veel verschillende cellijnen worden gekweekt en ze kunnen verschillende vormen en maten aannemen, afhankelijk van het gebruikte celtype en hun assemblagemethode3. Bovendien kunnen sferoïden ook worden aangeduid als meercellige tumorsferoïden (MCTS) wanneer ze worden gekweekt uit kankercellijnen, en deze modellen hebben een bijzonder gebruik gevonden voor preklinische in vitro medicijnafgifte en toxiciteitsstudies4,5. Organoïden daarentegen zijn bedoeld om de weefsels en organen in ons lichaam beter na te bootsen en kunnen complexere morfologische arrangementen aannemen. De productie van organoïden omvat het gebruik van volwassen stamcellen of pluripotente stamcellen, die kunnen worden geherprogrammeerd in de juiste cellen om op het weefsel of orgaan van belang te lijken. Ze worden voornamelijk gebruikt om de ontwikkeling van organen te onderzoeken en om ziekten en gastheer-pathogeen interacties te modelleren6.
Er is een reeks verschillende methoden die worden gebruikt om 3D-celassemblages te genereren. Steigergebaseerde methoden bieden een substraat of ondersteuning waaraan cellen zich kunnen hechten of erin kunnen groeien. Deze steigers kunnen verschillende vormen hebben en kunnen gemaakt worden van verschillende materialen. De meest voorkomende zijn extracellulaire matrix (ECM) componenten en hydrogels, en ze zijn ontworpen om te lijken op de natuurlijke extracellulaire omgeving van cellen en daardoor fysiologische interacties te vergemakkelijken4,7. ECM-keldermateriaal is geëxtraheerd uit engelbreth-Holm-Swarm muizensarcoomtumor en heeft aangetoond dat het een rijk mengsel van ECM-componenten bevat, waaronder laminine, type IV collageen en perlecan8. Ondanks de voordelige samenstelling zijn er echter twee belangrijke uitdagingen met betrekking tot het gebruik ervan, namelijk de batch-to-batch variabiliteit en dat het twee verschillende aggregaattoestanden heeft onder en boven 10 °C8,9. Hydrogels hebben daarentegen het voordeel dat ze flexibel zijn met betrekking tot hun componenten en stijfheid, en ze kunnen worden aangepast aan de specifieke gewenste 3D-celassemblage7,10. Scaffold-gebaseerde methoden zijn essentieel voor organoïde groei, maar worden ook veel gebruikt voor sferoïden. Steigervrije methoden, die werken door te voorkomen dat cellen zich hechten aan het oppervlak waarop ze groeien, zijn meestal alleen compatibel met sferoïde assemblage. Voorbeelden hiervan zijn ultra-low attachment (ULA) platen, met een platte bodem of U-bodem, die aggregatie van de cellen tot sferoïden mogelijk maken, of het gebruik van continue agitatie van de cellen in spinner/ rotatiekolven10.
Het gebruik van 3D-celassemblages om een breed scala aan biologische gebeurtenissen te bestuderen, wint snel aan populariteit; het is echter van essentieel belang dat de voor hun cultuur gekozen methode geschikt en verenigbaar is met de plannen voor hun downstream-analyse. Het gebruik van ULA-platen genereert bijvoorbeeld sferoïden met een hoge consistentie; deze methode is echter beperkt tot de productie van een enkele sferoïde per put, waardoor de doorvoer wordt beperkt. Bijzondere aandacht is nodig wanneer fluorescentiebeeldvorming van de 3D-structuur wordt gepland. Het substraat of de plaat waarop de assemblage wordt gekweekt, moet optisch compatibel zijn en er moet voor worden gezorgd dat de effecten van lichtverstrooiing veroorzaakt door eventuele steigers die mogelijk zijn gebruikt, worden geminimaliseerd11. Dit specifieke probleem wordt acuter naarmate het numerieke diafragma van de microscoop objectieflenzen toeneemt.
Misschien wel een van de belangrijkste redenen om ervoor te kiezen om met een 3D-celmodel te werken, is om volumetrische beeldvormingsgegevens te extraheren over niet alleen de hele assemblage, maar ook over de individuele cellen erin. McTS-modellen, in het bijzonder, beginnen zeer krachtig te blijken voor het verdiepen van ons begrip van hoe therapeutica van buitenaf naar centrale cellen gaan (zoals ze nodig zouden hebben in een tumor)12, en dus is het verkrijgen van kennis van individuele cellen op verschillende lagen essentieel. De beeldvormingstechnologie die kwantitatieve informatie uit individuele cellen haalt, wordt high-content analysis (HCA) genoemd en is een krachtige aanpak in de context van screening13. Tot op heden is HCA bijna uitsluitend toegepast op monolaagculturen, maar er is een toenemend besef dat deze benadering de kracht heeft om te worden toegepast op 3D-culturen, waardoor een breed scala aan cellulaire functies en processen kan worden bestudeerd14. Het zou het duidelijke voordeel hebben dat grote aantallen 3D-assemblages kunnen worden geanalyseerd, waardoor mogelijk gegevens op celniveau van elke structuur kunnen worden geleverd. Uitdagingen in verband met beeldvorming van potentieel dikke celassemblages, evenals de grote gegenereerde datasets, moeten echter worden overwonnen.
In dit artikel wordt een robuuste steigergebaseerde methode gepresenteerd voor de grootschalige productie van MCTS in een 96-well formaat. De methode vergemakkelijkt de productie van enkele honderden 3D-celassemblages in elke put. Voorbeelden worden getoond voor drie verschillende celtypen, die solide tumormodellen van de lever, longen en dikke darm vertegenwoordigen. De sferoïden die zich vormen kunnen van verschillende grootte zijn, en dus wordt HCA gebruikt om structuren van een bepaalde grootte en / of morfologie te selecteren. Deze functie biedt het extra voordeel dat alle waargenomen fenotypen kunnen worden vergeleken tussen sferoïden van verschillende grootte, maar allemaal op dezelfde manier in dezelfde put worden behandeld. Deze aanpak is compatibel met beeldvorming met hoge resolutie en levert zowel kwantitatieve gegevens op celniveau als op subcellulair niveau van dezelfde cellulaire assemblages. Deze methode van sferoïde productie heeft het bijkomende voordeel ten opzichte van methoden die een enkele sferoïde per put genereren, dat de grote aantallen sferoïden die in elke put worden geproduceerd, mogelijk voldoende biomassa leveren voor andere stroomafwaartse analyses, zoals transcriptoom- en proteoomprofilering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek
- Media voorbereiden
- Bereid specifieke celkweekmedia voor, afhankelijk van het type cellijn. Zorg ervoor dat alle media voor celonderhoud 10% Foetaal Runderserum (FBS) bevatten.
OPMERKING: Verschillende cellijnen gebruiken verschillende media. HT-29 coloncarcinoomcellen (ATCC HTB-38) worden gekweekt in McCoys 5A + 10% FBS. HepG2 hepatocellulaire carcinoomcellen (ATCC HB-8065) worden gekweekt in Minimum Essential Medium + 1% L-glutamine + 10% FBS. H358 bronchoalveolaire carcinoomcellen (ATCC CRL-5807) worden gekweekt in RPMI 1640 medium + 1% L-glutamine + 10% FBS. Alle media die L-glutamine en FBS bevatten, worden complete media genoemd. Bij het plateren van cellen om als sferoïden te groeien, is een fenolroodvrij medium met 10% FBS vereist om kleuring van het ECM-keldermateriaal te voorkomen, wat op zijn beurt artefacten kan veroorzaken tijdens het beeldvormingsproces.
- Bereid specifieke celkweekmedia voor, afhankelijk van het type cellijn. Zorg ervoor dat alle media voor celonderhoud 10% Foetaal Runderserum (FBS) bevatten.
- Subcultuur cellen
- Wanneer cellen voor ongeveer 80% samenvloeien, was dan kort met 2 ml trypsine-EDTA (0,25% (w/v) trypsine/0,53 mM EDTA). Zuig de trypsine-EDTA op, voeg 3 ml verse trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 3-5 min bij 37 °C.
- Wanneer cellen zijn losgemaakt van de celkweekschaal, voeg dan 7 ml vers volledig medium toe.
- Pipetteer 1 ml celsuspensie in een nieuwe celkweekschaal van 10 cm en voeg 9 ml vers volledig medium toe om een verdunning van de cellen van 1:10 te geven.
- Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Subcultureer de cellen om de 3-5 dagen, afhankelijk van de cellijn.
2. Generatie van sferoïden
- Coat 96-well platen met ECM keldermateriaal
- Ontdooi ECM keldermateriaal op ijs een nacht.
- Verdun ECM-keldermateriaal in koud fenolroodvrij serumvrij medium met voorgekoelde uiteinden die op -20 °C worden gehouden.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van ECM-keldermateriaal is afhankelijk van de gebruikte cellijn. Gebruik voor HT-29- en H358-cellen 4 mg ML-1 ECM-keldermateriaal . Gebruik voor HepG2-cellen 4 mg·ml-1 ecm-keldermateriaal met verminderde groeifactor. - Pipetteer 15 μL van het ECM-keldermateriaal/mediumoplossing in een 96-well imaging plate.
OPMERKING: Voor grootschalige sferoïde productie kan deze stap worden uitgevoerd met zowel een 8-kanaals pipet als een 96-kanaals pipetteerkop, zolang de uiteinden en het reservoir met het ECM-keldermateriaal worden gekoeld. - Centrifugeer de plaat gedurende 20 minuten bij 91 x g bij 4 °C.
- Incubeer de plaat niet langer dan 30 minuten bij 37 °C.
- Subcultuur en telcellen
- Incubateer tijdens de plaatincubatieperiode de cellen met trypsine-EDTA en resuspend ze in een volledig medium dat 10% FBS bevat.
- Pipetteer 10 μL van de celsuspensie in een hemocytometertelkamer. Tel het aantal cellen in 4 kwadranten van de kamer.
- Bereken het aantal cellen in de celsuspensie door het gemiddelde aantal cellen binnen de 4 kwadranten te bepalen.
OPMERKING: Cellen kunnen ook worden geteld met behulp van geautomatiseerde celtelapparaten. - Centrifugeer de cellen bij 135 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Zodra de cellen zijn gepelletiseerd, zuigt u het supernatant op en resuspendeert u de cellen in een fenolroodvrij volledig medium om een concentratie van 1 x 106 cellen per ml te verkrijgen.
- Zaadcellen in ecm-keldermateriaal gecoate platen
- Verdun de cellen in een fenolroodvrij volledig medium.
OPMERKING: De dichtheid van de gezaaide cellen is afhankelijk van de gebruikte cellijn. Voor HT-29- en HepG2-cellen worden 3 x 104 cellen per put gezaaid; voor H358-cellen worden 4 x 104 cellen per put gezaaid. - Zaai de cellen in een totaal volume van 35 μL per put. Zorg ervoor dat je ze druppelsgewijs toevoegt in een cirkelvormige beweging.
OPMERKING: Voor grootschalige sferoïde productie kan deze stap worden uitgevoerd met een 8-kanaals pipet, zolang de pipetterende cirkelvormige beweging kan worden bereikt. - Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Bereid een oplossing van ECM-keldermateriaal in fenolroodvrij volledig medium, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 2% ECM-keldermateriaal in de put. Om dit te bereiken, voegt u 1,2 μL ECM-keldermateriaal toe aan 23,8 μL fenolroodvrij volledig medium per put, wat resulteert in een eindvolume van 60 μL per put.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Vervang de volgende dag het medium door 100 μL vers fenol roodvrij volledig medium.
- Vervang het medium om de twee dagen door 100 μL vers fenol roodvrij volledig medium.
- Verdun de cellen in een fenolroodvrij volledig medium.
3. Immunofluorescentiekleuring van sferoïden
OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Nürnberg et al., 202015. Deze aanpassingen zijn voornamelijk gebaseerd op het feit dat de in dit protocol beschreven sferoïden kleiner zijn dan die welke in het werk van Nürnberg et al. worden gebruikt15 en als zodanig kortere incubatietijden mogelijk maken. Zo worden de blokkeringstijden teruggebracht van 2 uur naar 1 uur. Omdat het protocol is ontworpen voor de productie van sferoïden met hoge doorvoer, worden bovendien alle verwerkingsstappen uitgevoerd in de put waarin de sferoïden worden gekweekt, wat betekent dat overdracht van individuele sferoïden in buizen niet vereist is.
- Bereid alle oplossingen en buffers voor die nodig zijn voor het bevestigen en beitsen
- Bereid Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door 1 PBS-tablet per 200 ml water toe te voegen. Autoclaaf de PBS.
- Bereid paraformaldehyde (PFA) volgens de stappen 3.1.3-3.1.4.
- Gebruik een verwarmde roerder om 400 ml PBS te verwarmen tot 60-70 °C in een zuurkast. Voeg al roerend 15 g PFA toe. Zodra de PFA is opgelost, voegt u 50 μL 1 M CaCl2 en 50 μL 1 M MgCl2 toe.
- Voeg 100 ml PBS toe om een eindvolume van 500 ml te maken. Gebruik NaOH om de PFA in evenwicht te brengen tot pH 7,4. Filtreer de PFA door steriele vacuümfilters (poriegrootte 0,22 μm), aliquot, en bewaar bij -20 °C.
- Bereid een 1 M glycine stock oplossing door 3,75 g glycine toe te voegen aan 50 ml PBS. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 5 ml permeabilisatiebuffer door 100 μl Triton X-100, 1 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en 1,5 ml 1 m glycine toe te voegen aan 2,4 ml PBS. Bewaren bij 4 °C gedurende niet langer dan 2 weken.
- Bereid 5 ml blokkerende buffer door 100 μl Triton X-100, 0,5 ml DMSO en 0,05 g runderserumalbumine (BSA) toe te voegen aan 4,9 ml PBS. Vul de blokkeerbuffer in buizen van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 5 ml antilichaamincubatiebuffer door 10 μl polysorbaat 20, 0,05 g BSA en 250 μl DMSO toe te voegen aan 4,74 ml PBS. Gebruik de incubatiebuffer van het antilichaam in buizen van 1,5 ml en bewaar deze bij -20 °C.
OPMERKING: In het hier beschreven protocol worden sferoïden alleen geassembleerd in de binnenste 60 putten van een 96-putplaat, hoewel ze in alle 96 putten van de plaat kunnen worden bereid. De reden voor het alleen voorbereiden van sferoïden in de binnenste 60 putten is dat sommige objectieve lenzen met een hoog numeriek diafragma niet in staat zijn om fysiek in staat te zijn om de hele put van de buitenste putten in beeld te brengen vanwege de 'rok' op sommige plaattypen. De bovenstaande volumes zijn voldoende voor de voorbereiding van 60 putten met sferoïden.
- Fixeren en permeabiliseren van de sferoïden
- Verwijder het medium voorzichtig uit de sferoïden en zorg ervoor dat de ECM-keldermateriaallaag niet wordt verstoord.
- Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
- Bevestig de sferoïden met 70 μL van 3% PFA gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
- Blus met 70 μL 0,5 M glycine-oplossing gedurende 30 min bij 37 °C.
- Permeabiliseer de sferoïden met behulp van 70 μL van de permeabilisatiebuffer gedurende 30 minuten bij RT.
- Was de sferoïden tweemaal met telkens 70 μL PBS gedurende 3 minuten.
- Incubeer de sferoïden in 70 μL blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Zodra de sferoïden zijn gefixeerd, kunnen alle volgende verwerkingsstappen worden uitgevoerd met behulp van een 8-kanaals pipet of een pipetteerkop met 96 putten, indien beschikbaar. Dit verhoogt de snelheid van sferoïde voorbereiding voorafgaand aan beeldvorming.
- Immunostain sferoïden met primaire en secundaire antilichamen
- Verdun het primaire antilichaam tot een geschikte verdunning in de incubatiebuffer van het antilichaam en voeg 70 μL toe aan elke put. Incubateer de sferoïden met het primaire antilichaam 's nachts.
OPMERKING: De verdunning is afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. In het hier getoonde voorbeeld worden lysosomen immunosmeer gekleurd met anti-LAMP1-antilichamen bij muizen met een verdunning van 1:500. - Was de volgende dag de sferoïden 5 keer met 70 μL PBS gedurende 3 minuten per keer.
- Verdun het secundaire antilichaam bij een verdunning van 1:500, fluorescerend geconjugeerd falloïdine bij 1:500 en Hoechst 33342 (uit een 1 mg ml-1-voorraad ) om 1:5000 in de incubatiebuffer van het antilichaam en voeg 70 μL toe aan elke put. Incubeer 's nachts.
OPMERKING: De verdunning van het antilichaam is afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt. Sterk geconvecteerde secundaire antilichamen die een hoge fotostabiliteit en hoge helderheid vertonen, worden aanbevolen. - Was de volgende dag de sferoïden 5 keer met 70 μL PBS gedurende 3 minuten per keer.
OPMERKING: Platen kunnen tot twee weken bij RT worden bewaard voordat ze worden afgebeeld, zolang de sferoïden bedekt blijven met PBS.
- Verdun het primaire antilichaam tot een geschikte verdunning in de incubatiebuffer van het antilichaam en voeg 70 μL toe aan elke put. Incubateer de sferoïden met het primaire antilichaam 's nachts.
4. Beeldacquisitie en analyse van sferoïden
- Beeldverwerving
- Plaats de 96-putplaat met sferoïden in een confocale screeningsmicroscoop met hoog gehalte.
- Selecteer de juiste lasers om de gebruikte fluoroforen te prikkelen.
- Verkrijg de kanalen sequentieel om cross-talk te voorkomen.
- Stel je de sferoïden voor met behulp van de juiste doelstellingen.
OPMERKING: Het gebruik van onderdompelingsdoelstellingen in water wordt aanbevolen indien beschikbaar. Een 20x/1.0 NA-objectief kan bijvoorbeeld een hele put in ~77 gezichtsvelden weergeven. Een 63x/1.15 NA objectief kan een hele put in ongeveer 826 beeldhoeken weergeven. - Afbeelding ~ 30-40 plakjes, afhankelijk van de diepte van de sferoïde, waarbij elke plak wordt genomen met een interval van 1,5 μm van de vorige.
- Beeldanalyse
- Voor morfologische analyse van sferoïden volgt u stappen 4.2.2-4.2.6.
- Segmenteer de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde falloïdinkleuring.
- Segmenteer de kernen op basis van de Hoechst 33342-kleuring.
- Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende Hoechst 33342-kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma.
- Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de sferoïden, waaronder volume, oppervlakte, sfericiteit en het aantal kernen per sferoïde.
OPMERKING: Deze informatie wordt geëxtraheerd met behulp van verschillende algoritmen die zijn ingebouwd in de beeldanalysesoftware van keuze. - Verwerk beelden verder om sferoïden kleiner dan 75.000 μm3 en groter dan 900.000 μm3 te verwijderen.
OPMERKING: Deze waarden zijn suggesties om de verwijdering mogelijk te maken van zeer kleine celassemblages en grote assemblages die kunnen zijn ontstaan als gevolg van de fusie van meerdere sferoïden. Sferoïden kunnen in deze stap ook worden onderverdeeld in verschillende grootteklassen. - Volg stappen 4.2.8-4.2.12 om afzonderlijke cellen in sferoïden te analyseren.
- Segmenteer de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde falloïdinkleuring.
- Segmenteer de kernen op basis van de Hoechst 33342-kleuring.
- Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende Hoechst 33342-kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma.
- Segmenteer de lysosomen op basis van de secundaire antilichaamkleuring.
- Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de cellen binnen elke sferoïde, inclusief het aantal lysosomen per cel, celvolume en celoppervlak.
OPMERKING: Deze informatie wordt geëxtraheerd met behulp van verschillende algoritmen die zijn ingebouwd in de beeldanalysesoftware van keuze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit protocol wordt een robuuste methode beschreven om 3D-celkweekassemblages in de vorm van sferoïden te produceren, waarbij verschillende celtypen worden gebruikt om verschillende tumorweefsels weer te geven. Deze methode maakt het mogelijk om honderden sferoïden per put te genereren, waardoor celgebaseerde assays op een hooggehalte kunnen worden uitgevoerd (figuur 1). Deze benadering is eerder gebruikt om de opname van nanodeeltjes in HT-29-sferoïden16 en door nanodeeltjes geïnduceerde toxiciteit in HepG2-sferoïden17 te bestuderen. De methode is gebaseerd op het produceren van een dunne en gelijkmatige verdeling van steigermateriaal over de putbodem van een optische kwaliteitsplaat. Cellen worden in elke put gezaaid en verder steigermateriaal, in een lage concentratie, wordt toegevoegd als een overlay op de cellen. Dit resulteert in een basis die zelfs de groei van sferoïden ondersteunt, wat betekent dat enkele honderden sferoïden kunnen worden gekweekt in elke put van een 96-putplaat. Een lage vergrotingsdoelstelling wordt gebruikt om een overzichtsbeeld van de gehele populatie te genereren (figuur 2). Subregio's van de put kunnen vervolgens worden geselecteerd en afgebeeld met behulp van een doel met hoge resolutie, en in elke positie wordt een volledige confocale stapel verkregen. Dit levert de nodige informatie op voor de daaropvolgende volumetrische analyse van elke sferoïde.
De individuele sferoïden kunnen vervolgens door HCA worden geanalyseerd, waardoor informatie wordt verkregen over de morfologische eigenschappen van de sferoïden. Meestal is de eerste stap om elke sferoïde als een enkel object te identificeren. Om dit te doen, wordt een fluorescentiekanaal geselecteerd dat waarschijnlijk consistente kleuring of distributie door de sferoïde zal geven. In het hier getoonde voorbeeld wordt het signaal in het fluorescerend geconjugeerde falloïdinekanaal gebruikt, omdat actine dicht bij het plasmamembraan wordt aangetroffen in alle cellen in de verschillende sferoïdetypen (figuur 2 en figuur 3A). Als gevolg van het genereren van volledige confocale stacks kunnen alle HCA-stappen op een volumetrische manier worden uitgevoerd in plaats van op een slice-by-slice-basis. Dit is belangrijk omdat het elke vertekening verwijdert die verband houdt met de analyse van een klein aantal geselecteerde vlakken. Deze volumetrische benadering wordt vervolgens toegepast op de andere kanalen in het beeld. De kernen werden gedetecteerd en gesegmenteerd op basis van de Hoechst 33342-kleuring, en hetzelfde kanaal kan worden gebruikt om het celcytoplasma te detecteren, omdat er resterend Hoechst 33342 aanwezig is op lage niveaus (figuur 3B). Als downstream-analyse van individuele cellen in de sferoïde nodig is, kunnen de andere kanalen (bijvoorbeeld lysosomen die zijn aangetast met anti-LAMP1-antilichamen) ook op een vergelijkbare manier worden verwerkt. De volumetrische benadering maakt het mogelijk om alle fluorescerend gelabelde structuren vanuit alle gezichtspunten te visualiseren (figuur 3C).
Nadat de sferoïde als een afzonderlijk object is geïdentificeerd, kunnen verschillende morfologische metingen op sferoïdeniveau worden uitgevoerd. Deze metingen omvatten de berekening van het aantal kernen per sferoïde (figuur 4A), evenals de sfericiteit (figuur 4B), volume (figuur 4C) en oppervlakte (figuur 4D) van de sferoïde. Afhankelijk van de gebruikte HCA-software kunnen ook andere morfologische kenmerken zoals doorsnede, binnenste schijfradius en binnenste bolradius worden berekend. In de hier getoonde voorbeelden werden sferoïden onder 75.000 μm3 en boven 900.000 μm3 uit de metingen verwijderd, maar deze parameters kunnen door de gebruiker worden ingesteld, afhankelijk van de gewenste sferoïde-eigenschappen voor analyse. Spreadsheets werden gegenereerd door de beeldanalysesoftware en geïmporteerd in RStudio voor analyse. Boxplotgrafieken werden geproduceerd om de morfologische eigenschappen van de verschillende soorten sferoïden weer te geven (figuur 4). Deze boxplots onthullen het niveau van sferoïde heterogeniteit in de populatie, daarom is het belangrijk om een groot aantal sferoïden in een experiment te kwantificeren. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van methoden die een enkele sferoïde per put genereren. De drie hier getoonde sferoïdetypen vertonen een hoge mate van gelijkenis met betrekking tot hun volume en oppervlakte, hoewel het opmerkelijk is dat de sfericiteit van HepG2-sferoïden iets lager is dan die van de andere hier getoonde typen (figuur 4B).
Het afbeelden van sferoïden met een hoge resolutie objectief, zoals de 63x waterdompelingsdoelstelling die hier wordt gebruikt, maakt het mogelijk om subcellulaire resolutie van individuele cellen in de sferoïde te bereiken. De verschillende organellen kunnen worden gesegmenteerd afhankelijk van de gebruikte antilichamen. In het hier getoonde voorbeeld werden lysosomen geïdentificeerd op basis van immunostaining met behulp van anti-LAMP1-antilichamen, gevolgd door secundaire antilichaamtoevoeging (figuur 3C). De segmentatie van elk organel binnen elke cel maakt het vervolgens mogelijk om metingen op celniveau te kwantificeren. Het typische volume van elke cel in de drie sferoïde typen (figuur 5A), evenals het aantal lysosomen per cel (figuur 5B), worden weergegeven. De behoefte aan dergelijke subcellulaire details wordt bepaald door de test waarin de sferoïden zullen worden gebruikt.
Het optimaliseren van de initiële celzaaidichtheid aan het begin van de sferoïdegeneratie is een cruciale stap. Het toevoegen van te veel cellen maakt nog steeds sferoïde vorming mogelijk; dit kan echter resulteren in de fusie van sferoïden (figuur 6). Dit leidt tot het genereren van onregelmatig gevormde assemblages, wat op zijn beurt zeer problematisch kan zijn voor de stroomafwaartse identificatie van de sferoïden. Wanneer sferoïden ten onrechte worden geïdentificeerd als verschillende structuren, kunnen er ook problemen zijn met de analyse van de individuele cellen. Als zodanig zijn zorgvuldige optimalisatie van elke cellijn die wordt gebruikt voor de sferoïdegeneratie, inclusief de celzaaidichtheid en de lengte van de groeitijd, kritieke parameters om vast te stellen.
Figuur 1: Schematische detaillering van het protocol dat wordt gebruikt om sferoïden te genereren voor HCS en HCA. 96-well platen worden gecoat met een laag ECM-keldermateriaal, gevolgd door zaaien van cellen, die vervolgens sferoïde vorming initiëren. Medium wordt de volgende dag en daarna om de twee dagen vervangen. Ter voorbereiding op beeldvorming worden sferoïden gefixeerd, gepermeabiliseerd en immunostained met specifieke antilichamen. Sferoïden worden vervolgens in beeld gebracht met behulp van een confocale HCS-microscoop. Afbeelding gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeldafbeeldingen van H358-, HepG2- en HT-29-sferoïden. Volledig geautomatiseerde HCS confocale beeldvorming van (A) H358, (B) HepG2 en (C) HT-29 sferoïden. Panelen tonen een enkel putoverzicht, evenals drie voorbeeld confocale plakjes en de volumetrische reconstructie van één sferoïde van elke cellijn. Kernen gekleurd met Hoechst 33342 worden weergegeven in blauw, actine gekleurd met fluorescerend geconjugeerd falloïdine in rood en lysosomen immuno gekleurd voor LAMP1 in groen. Beelden van het putoverzicht werden gemaakt met een 20x waterdompelingsobjectief (NA 1.0). Beelden van individuele sferoïden werden verkregen met een 63x waterdompelingsobjectief (NA 1.15). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van belangrijke stappen in beeldanalyse. (A) Elke sferoïde wordt voor het eerst geïdentificeerd in volumetrische modus door detectie van de fluorescerend geconjugeerde falloïdekleuring. (B) Met behulp van deze informatie als masker wordt het cytoplasma van elke cel gesegmenteerd door de resterende Hoechst 33342-kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma. De kernen zijn gesegmenteerd door de Hoechst 33342 beits. De lysosomen worden gesegmenteerd met behulp van het antilichaam (anti-LAMP1) immunostaining. Volumetrische weergaven worden weergegeven. (C) 3-vlaks weergaven van dezelfde sferoïde. Het getoonde voorbeeld is van een H358-celsferoïde. Beelden werden verkregen met een 63x waterdompelingsobjectief (NA 1.15) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van metingen op sferoïdeniveau. Alle metingen werden gedaan met behulp van een geautomatiseerde beeldanalysepijplijn en voor drie soorten sferoïden, namelijk H358, HepG2 en HT-29, afgebeeld met een 20x objectief. Getoond zijn (A) gemiddeld aantal kernen per sferoïde, (B) sferoïde sfericiteit, (C) sferoïde volume en (D) sferoïde oppervlakte. Alle boxplots tonen de mediaanwaarde en kwartielen voor elk sferoïde type. De gegevens zijn afkomstig van 3 repliceerputten; het totale aantal geanalyseerde sferoïden waren 1259 (H358), 1522 (HepG2) en 1326 (HT-29). Beelden werden verkregen met een 20x waterdompelingsobjectief (NA 1.0). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van metingen op celniveau van sferoïden. Alle metingen werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde beeldanalysepijplijn en voor drie soorten sferoïden, namelijk H358, HepG2 en HT-29, afgebeeld met een 63x-objectief. Getoond worden (A) volumes van individuele cellen, en (B) gemiddelde aantallen lysosomen per cel. Het totale aantal geanalyseerde cellen was 1410 (H358), 1625 (HepG2) en 1401 (HT-29), van 20 sferoïden van elke cellijn. Beelden werden verkregen met een 63x waterdompelingsobjectief (NA 1.15) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeldafbeeldingen met effecten van overplating van cellen op sferoïdevorming. Er worden voorbeeldafbeeldingen getoond voor H358-, HepG2- en HT-29-sferoïden. Pijlen geven plaatsen aan waar sferoïden waarschijnlijk zijn gefuseerd. Beelden werden verkregen met een 20x waterdompelingsobjectief (NA 1.0). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven aanpak beschrijft een platform voor het genereren van enkele honderden sferoïden per put op een manier die geschikt is voor HCS en HCA. In vergelijking met andere populaire methoden, zoals het gebruik van platbodem- en ULA-platen met ronde bodem, die de vorming van slechts één sferoïde per put mogelijk maken18,19, biedt deze methode de mogelijkheid om informatie met hoge resolutie te extraheren uit grote aantallen sferoïden in een screeningsformaat. Met name is deze methode gedemonstreerd in 3 verschillende cellijnen, die verschillende tumortypen vertegenwoordigen, wat de brede geschiktheid benadrukt om een reeks cellulaire processen in verschillende modellen te bestuderen. Hoewel de sferoïden die met deze methode worden gegenereerd enige variabiliteit in grootte en vorm vertonen, kan HCA ze gemakkelijk classificeren op grootte (of andere relevante parameters). Ons laboratorium heeft deze aanpak met succes gebruikt om door nanodeeltjes geïnduceerde toxiciteit te bestuderen als een functie van de grootte van sferoïden. Belangrijk is dat alle verschillende grootteklassen van sferoïden in dezelfde put kunnen worden bestudeerd, wat betekent dat ze allemaal werden blootgesteld aan identieke behandelingen, wat zeer robuuste outputs van een grote sferoïde populatie oplevert17. De hier beschreven methodologie kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere celtypen die verschillende weefsels vertegenwoordigen. Bovendien kunnen dergelijke sferoïden worden gebruikt om verschillende biologische processen te beoordelen14. Als de sferoïden worden gegenereerd met cellen die stabiel fluorescerend gelabelde eiwitten tot expressie brengen, is live cell imaging ook mogelijk.
Een cruciale stap in dit protocol is de productie van de ECM-keldermateriaallaag waarop de cellen zijn verguld. Wanneer de laag te dik is, kan deze een meniscus20 vormen die de groei van monolagen in het midden van de put en sferoïden alleen aan de buitenranden van de put bevordert. Daarom is het essentieel dat de juiste concentratie en het juiste volume van het ECM-keldermateriaal wordt gekozen om uniforme sferoïdevorming door de put mogelijk te maken; dit is altijd cellijnafhankelijk. Ook van belang is dat overtollig ECM-keldermateriaal problemen kan veroorzaken tijdens het immunostainingproces, omdat het niet gemakkelijk kan worden opgelost. Dit kan op zijn beurt leiden tot complicaties tijdens het verkrijgen van beelden bij het gebruik van een HCS confocale microscoopsysteem. Een andere overweging is dat verschillende cellijnen verschillende ECM-formuleringen kunnen vereisen. HepG2-sferoïden vereisen bijvoorbeeld ECM-keldermateriaal met een verminderde concentratie van groeifactoren, vergeleken met die gebruikt door H358- en HT-29-sferoïden. De methode van celplating is ook belangrijk, omdat dit bepaalt hoe de cellen in de put worden verdeeld. Wanneer er te veel cellen worden gezaaid of wanneer ze slecht verdeeld zijn, kan dit leiden tot sferoïde fusie (figuur 6). Een andere uitdaging van het gebruik van ECM-steigers is dat ze bij lage temperaturen (onder 10 °C) moeten worden gehanteerd, wat vooral problematisch is bij het gebruik van automatisering voor HCS. Dit probleem werd echter onlangs opgelost door Eismann en collega's (2020), die microarray-technologie gebruikten om 0,2 μL druppels ECM-keldermateriaal en cellen in kamerdia's te herkennen. Dit was voldoende materiaal om de groei van kleine sferoïden21 te vergemakkelijken. Of een dergelijke aanpak ook zou werken voor het platen van grotere volumes ECM-keldermateriaal in putten van multi-well platen, moet nog worden aangetoond.
Een probleem in verband met de analyse van 3D-celmodellen met behulp van microscopie is de mogelijkheid om informatie te extraheren uit de centrale vlakken van deze assemblages. In dit opzicht kunnen permeabilisatie en toegang tot antilichamen tijdens het immunostainingproces problematisch zijn. Het protocol gepubliceerd door Nürnberg en collega's15 maakt echter een zeer consistente immunostaining van de gehele sferoïde mogelijk. Met behulp van kleine aanpassingen aan dit protocol kan deze techniek zelfs kleine subcellulaire structuren (bijvoorbeeld lysosomen) immunosmuleren, met een hoge mate van consistentie, ongeacht of de cellen centraal of perifeer zijn met betrekking tot de algehele sferoïde structuur. Het is belangrijk dat deze stap zorgvuldig wordt geoptimaliseerd bij het gebruik van nieuwe antilichamen.
Een andere cruciale stap is het gekozen beeldvormingsregime. Het is belangrijk om het juiste aantal z-slices door de sferoïde in beeld te brengen, omdat dit het volume aan gegevens bepaalt dat moet worden geanalyseerd en opgeslagen. Het in beeld brengen van een beperkt aantal z-vlakken met een te groot interval kan bijvoorbeeld resulteren in een onderschatting van de totale sferoïdegrootte en het totale volume. Aan de andere kant kan het vastleggen van te veel z-planes leiden tot data-analyse en opslagproblemen. Zeer grote datasets vereisen ook een intensievere rekenkracht voor hun analyse, met name in volumetrische modus. Het optimale bemonsteringsinterval in het z-vlak wordt grotendeels bepaald door de kenmerken van de objectieflens, maar voor de hier getoonde voorbeelden zijn ca. 40 confocale plakjes nodig met een interval van 1,5 μm om beeldvorming door de gehele diepte van de sferoïde te vergemakkelijken.
Zoals gezegd, om bias van analyse van geselecteerde vlakken te verminderen, wordt het gebruik van een op volumetrische beeldanalyse gebaseerde benadering sterk aanbevolen. Hierdoor kan niet alleen informatie op sferoïdeniveau worden geëxtraheerd, maar ook gegevens op celniveau van elke individuele sferoïde. Uiteindelijk moeten de HCA-pijpleidingen zo worden ontworpen dat ze de specifieke biologische vraag aanpakken die wordt gesteld. Multiparametrische uitgangen maken het mogelijk om complexe fenotypen kwantitatief te beschrijven. Het is aangetoond dat dit werkt voor 3D-celassemblages met behulp van commerciële HCA-software16,17, evenals vrij toegankelijke software zoals CellProfiler22,23. Volumetrische analysemethoden hebben het potentieel om te worden toegepast op andere 3D-celmodeltypen, zoals organoïden en ex vivo patiënt-afgeleide explantaten (PDE's), die nog beter in vivo omstandigheden repliceren. Onlangs is een high-throughput pijplijn voor de productie van hersenorganoïden beschreven24. Dit omvat het genereren van organoïden in een 96-putplaat en deze vervolgens in beeld brengen met behulp van een screeningsmicroscoop met een hoog gehalte24. PDE's zijn zeer voordelig omdat ze de oorspronkelijke histologie van de tumor vertonen, waardoor een celmodel wordt geboden dat in vivo aandoeningen samenvat, inclusief kenmerken zoals de micro-omgeving van de tumor25. Deze modellen kunnen in principe ook immuungekleurd, afgebeeld en geanalyseerd worden met behulp van de hier beschreven aanpak26,27.
Samengevat beschrijft dit protocol een toegankelijke en robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor HCS- en HCA-toepassingen. De toepasbaarheid ervan wordt getoond met drie verschillende cellijnen, waardoor sferoïden ontstaan die met hoge resolutie in beeld kunnen worden gebracht. Dit protocol toont ook aan dat volumetrische analyse kwantitatieve informatie kan verschaffen over de sferoïde populatie, evenals op het eencellige en subcellulaire niveau, waardoor het nuttig is voor een breed scala aan assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen verbonden zijn aan dit werk.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de steun van een infrastructuuronderzoekssubsidie van Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) aan JCS. Het werk in het UCD Cell Screening Laboratory wordt ondersteund door het UCD College of Science. ASC wordt gefinancierd door een Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG / 2019 / 68). De auteurs bedanken ook alle leden van het lab voor hun input en nuttige discussies. Het kunstwerk in figuur 1 is gegenereerd in BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C.
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
