En robust metod för storskalig produktion av sfäroider för screening- och analysapplikationer med högt innehåll
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för produktion av tre olika typer av sfäroider på ett sätt som gör dem lämpliga för storskalig screening och analys med högt innehåll. Dessutom presenteras exempel som visar hur de kan analyseras på sfäroid- och individcellsnivåer.
Abstract
Höginnehållsscreening (HCS) och höginnehållsanalys (HCA) är tekniker som ger forskare möjlighet att extrahera storskaliga kvantitativa fenotypiska mätningar från celler. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara kraftfullt för att fördjupa vår förståelse av ett brett spektrum av både grundläggande och tillämpade händelser inom cellbiologi. Hittills har majoriteten av applikationerna för denna teknik förlitat sig på användningen av celler som odlas i monoskikt, även om det alltmer insers att sådana modeller inte rekapitulerar många av de interaktioner och processer som förekommer i vävnader. Som sådan har det skett en framväxt i utveckling och användning av 3-dimensionella (3D) cellenheter, såsom sfäroider och organoider. Även om dessa 3D-modeller är särskilt kraftfulla i samband med cancerbiologi och läkemedelsleveransstudier, utgör deras produktion och analys på ett reproducerbart sätt som lämpar sig för HCS och HCA ett antal utmaningar. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för generering av multicellulära tumör sfäroider (MCTS), och visar att det kan tillämpas på tre olika cellinjer på ett sätt som är kompatibelt med HCS och HCA. Metoden underlättar produktionen av flera hundra sfäroider per brunn, vilket ger den specifika fördelen att när de används i ett screeningsystem kan data erhållas från flera hundra strukturer per brunn, alla behandlade på ett identiskt sätt. Exempel ges också, som beskriver hur man bearbetar sfäroiderna för högupplöst fluorescensavbildning och hur HCA kan extrahera kvantitativa funktioner både på sfäroidnivå och från enskilda celler inom varje sfäroid. Detta protokoll kan enkelt tillämpas för att svara på ett brett spektrum av viktiga frågor inom cellbiologi.
Introduction
Traditionellt har cellbaserade analyser utförts i monoskikt som växer på ett fast substrat, vilket effektivt kan betraktas som en tvådimensionell (2D) miljö. Det blir dock alltmer erkänt att 2D-cellkulturmodeller saknar fysiologisk relevans i vissa sammanhang och inte kan replikera många av de komplexa interaktioner som uppstår mellan celler1. Tredimensionella (3D) cellodlingsmetoder blir snabbt populära bland forskare, och 3D-cellmodeller visar hög potential att bättre efterlikna de fysiologiska förhållanden som celler i vävnadsmiljön möter2. Det finns flera olika typer av 3D-cellenheter som har använts, men de två vanligaste typerna är sfäroider och organoider. Sfäroider kan odlas från många olika cellinjer, och de kan anta olika former och storlekar beroende på vilken celltyp som används och deras monteringsmetod3. Dessutom kan sfäroider också kallas multicellulära tumörsfäroider (MCTS) när de odlas från cancer cellinjer, och dessa modeller har funnit särskild användning för preklinisk in vitro-läkemedelsleverans och toxicitetsstudier4,5. Organoider, å andra sidan, syftar till att bättre efterlikna vävnader och organ i vår kropp och kan anta mer komplexa morfologiska arrangemang. Produktionen av organoider innebär användning av vuxna stamceller eller pluripotenta stamceller, som kan omprogrammeras till lämpliga celler för att likna den vävnad eller det organ som är av intresse. De används främst för att undersöka utvecklingen av organ och för att modellera sjukdomar och värdpatogeninteraktioner6.
Det finns en rad olika metoder som används för att generera 3D-cellenheter. Ställningsbaserade metoder ger ett substrat eller stöd till vilket celler antingen kan fästas eller växa inuti. Dessa byggnadsställningar kan ha olika former och kan tillverkas av en mängd olika material. De vanligaste är extracellulära matriskomponenter (ECM) och hydrogeler, och de är utformade för att likna cellernas naturliga extracellulära miljö och därigenom underlätta fysiologiska interaktioner4,7. ECM källarmaterial har extraherats från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom tumör och visat sig innehålla en rik blandning av ECM komponenter, inklusive laminin, typ IV kollagen och perlecan8. Trots dess fördelaktiga sammansättning finns det dock två huvudutmaningar med dess användning, nämligen dess variabilitet från parti till parti och att den har två olika aggregerade tillstånd under och över 10 °C8,9. Däremot har hydrogeler fördelen att de är flexibla med avseende på sina komponenter och styvhet, och de kan anpassas för att passa den specifika 3D-cellenheten som önskas7,10. Ställningsbaserade metoder är viktiga för organoid tillväxt men används också i stor utsträckning för sfäroider. Ställningsfria metoder, som fungerar genom att förhindra att celler fästs på ytan de växer på, är vanligtvis endast kompatibla med sfäroidmontering. Exempel är ultralåga ULA-plattor(ULA), med antingen en platt botten eller U-botten, som möjliggör aggregering av cellerna i sfäroider, eller användning av kontinuerlig omrörning av cellerna i spinner/rotationskolvar10.
Användningen av 3D-cellenheter för att studera en mängd olika biologiska händelser blir snabbt populär; Det är dock viktigt att den metod som valts för deras kultur är lämplig och förenlig med planerna för deras nedströmsanalys. Till exempel genererar användningen av ULA-plattor sfäroider med hög konsistens; Denna metod är dock begränsad till produktion av en enda sfäroid per brunn, vilket begränsar genomströmningen. Särskild hänsyn behövs när fluorescensavbildning av 3D-strukturen planeras. Det substrat eller den platta på vilken monteringen odlas måste vara optiskt kompatibel, och försiktighet måste vidtas för att minimera effekterna av ljusspridning orsakad av eventuella byggnadsställningar som kan ha använts11. Detta speciella problem blir mer akut när mikroskopmållinsernas numeriska bländare ökar.
Förmodligen är en av de främsta anledningarna till att välja att arbeta med en 3D-cellmodell att extrahera volymetriska bilddata om inte bara hela enheten utan också de enskilda cellerna i den. MCTS-modeller, i synnerhet, börjar visa sig vara mycket kraftfulla för att fördjupa vår förståelse för hur terapeutiska transitering från utsidan till centrala celler (som de skulle behöva i en tumör)12, och därför är det viktigt att få kunskap från enskilda celler vid olika lager. Den bildteknik som extraherar kvantitativ information från enskilda celler kallas höginnehållsanalys (HCA) och är ett kraftfullt tillvägagångssätt i samband med screening13. Hittills har HCA nästan uteslutande tillämpats på monolayerkulturer, men det finns en ökande insikt om att detta tillvägagångssätt har kraften att tillämpas på 3D-kulturer som gör det möjligt att studera ett brett spektrum av cellulära funktioner och processer14. Det skulle ha den tydliga fördelen att ett stort antal 3D-sammansättningar kunde analyseras, vilket potentiellt ger data på cellnivå från alla strukturer. Utmaningar i samband med avbildning av potentiellt tjocka cellenheter, liksom de stora datamängder som genereras, måste dock övervinnas.
I den här artikeln presenteras en robust ställningsbaserad metod för storskalig produktion av MCTS i ett 96-välformat. Metoden underlättar produktionen av flera hundra 3D-cellenheter i varje brunn. Exempel visas för tre olika celltyper, som representerar solida tumörmodeller av lever, lunga och kolon. Sfäroiderna som bildas kan vara av olika storlekar, så HCA används för att välja strukturer av en viss storlek och / eller morfologi. Denna funktion ger den extra fördelen att alla fenotyper som observeras kan jämföras över sfäroider av olika storlekar, men alla behandlas på samma sätt i samma brunn. Detta tillvägagångssätt är kompatibelt med högupplöst avbildning, vilket i huvudsak ger både kvantitativa data på cellnivå och subcellulär nivå från samma cellulära sammansättningar. Denna metod för sfäroid produktion har den extra fördelen jämfört med metoder som genererar en enda sfäroid per brunn, att det stora antalet sfäroider som produceras i varje brunn potentiellt ger tillräcklig biomassa för andra nedströmsanalyser, såsom transkriptom och proteomprofilering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs här beskriver en plattform för att generera flera hundra sfäroider per brunn på ett sätt som är lämpligt för HCS och HCA. I jämförelse med andra populära metoder, såsom användning av plattbottnade och rundbottnade ULA-plattor, som tillåter bildandet av endast en sfäroid per brunn18,19, ger denna metod möjlighet för högupplöst information att extraheras från ett stort antal sfäroider i ett screeningformat. Denna metod har …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stödet från ett infrastrukturforskningsbidrag från Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) till JCS. Arbetet i UCD Cell Screening Laboratory stöds av UCD College of Science. ASC finansieras av Irish Research Council (IRC) Government of Ireland Postgraduate Scholarship (GOIPG/2019/68). Författarna tackar också alla medlemmar i labbet för deras input och hjälpsamma diskussioner. Konstverket i figur 1 genererades i BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
