JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Analyse med høj kapacitet af ikke-fotokemisk slukning i afgrøder ved hjælp af pulsamplitudemoduleret klorofylfluoretiometri

Published: July 06, 2022
doi:
10.3791/63485
, , , , ,
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences,University of Cambridge

Summary

Protokollen introducerer en metode med høj kapacitet til måling af afslapning af ikke-fotokemisk slukning ved pulsamplitudemoduleret klorofylfluoremetri. Metoden anvendes på markdyrket Glycine max og kan tilpasses andre arter for at screene for genetisk mangfoldighed eller avlspopulationer.

Abstract

Fotosyntese er ikke optimeret i moderne afgrøde sorter, og giver derfor mulighed for forbedring. Fremskyndelse af lempelsen af ikke-fotokemisk slukning (NPQ) har vist sig at være en effektiv strategi til at øge fotosyntetisk ydeevne. Potentialet til at avle for forbedret NPQ og en fuldstændig forståelse af det genetiske grundlag for NPQ-afslapning mangler imidlertid på grund af begrænsninger i oversampling og dataindsamling fra markdyrkede afgrødeplanter. På baggrund af tidligere rapporter præsenterer vi et high-throughput assay til analyse af NPQ-afslapningshastigheder i Glycine max (sojabønne) ved hjælp af pulsamplitudemoduleret (PAM) klorofylfluoretri. Bladskiver udtages fra markdyrkede sojabønner inden transport til et laboratorium, hvor NPQ-afslapning måles i et lukket PAM-fluorometer. NPQ-afslapningsparametre beregnes ved at tilpasse en bi-eksponentiel funktion til de målte NPQ-værdier efter en overgang fra højt til svagt lys. Ved hjælp af denne metode er det muligt at teste hundredvis af genotyper inden for en dag. Proceduren har potentialet til at screene mutant- og mangfoldighedspaneler for variation i NPQ-afslapning og kan derfor anvendes på både grundlæggende og anvendte forskningsspørgsmål.

Introduction

Fotosyntese består af lysabsorption, primær elektronoverførsel, energistabilisering og syntese og transport af fotosyntetiske produkter1. Forståelse af hvert trin er afgørende for at guide bestræbelserne på at øge beskæringsfotosyntetisk effektivitet. Lys påvirker fotosyntesehastigheden, hvilket kræver balancering af energiforsyningen i form af fotoner med efterspørgsel efter reducerende ækvivalenter. Når udbuddet overstiger efterspørgslen, f.eks. under højlys eller under reduceret CO2 -fiksering forårsaget af stomatal lukning, øger opbygning af reducerende effekt sandsynligheden for reaktiv iltartdannelse med potentiale til at beskadige det fotosyntetiske apparat og forringe elektrontransporten. For at forhindre skade har planter derfor udviklet flere fotobeskyttende mekanismer, herunder afgiftning af reaktive iltarter og ikke-fotokemisk slukning af de ophidsede klorofyltilstande (NPQ)2.

Opretholdelse af høje fotosyntesehastigheder er udfordrende under et feltmiljø. Sæsonmæssige og daglige ændringer sammen med miljømæssige udsving såsom vindinducerede bladbevægelser og forbigående skydække forårsager skift i mængden og intensiteten af lys, der modtages af planter til fotosyntese3. NPQ spreder overskydende lysenergi og kan hjælpe med at forhindre fotoskader, samtidig med at der gives mulighed for vedvarende fotosyntesehastigheder ved højlys4. Imidlertid fortsætter langvarig NPQ under overgange i højt til svagt lys med at sprede energi, der kan bruges til kulstofreduktion5. Som følge heraf kan fremskyndelse af lempelsen af NPQ øge effektiviteten af fotosyntese6, hvilket gør NPQ-afslapning til et attraktivt mål for afgrødeforbedring.

Pulsamplitudemoduleret klorofylfluorescensanalyse (PAM) kan bruges til at beregne NPQ ud fra målbare parametre (supplerende tabel 1 og supplerende tabel 2)7,8,9. Denne artikel fokuserer på at bestemme NPQ-afslapningshastigheder i markdyrkede planter med det formål at screene naturlig variation i germplasm. Imidlertid kan PAM klorofylfluorometrianalyse også anvendes til en lang række formål, anvendes på arter lige fra alger til højere planter og gennemgås andetsteds 7,8,9.

I et mørkt tilpasset blad eller celle er fotosystem II (PSII) reaktionscentre åbne for at modtage elektroner, og der er ingen NPQ. Tænding af et lavintensitetsmålingslys fremkalder klorofylfluorescens, samtidig med at elektrontransport gennem PSII undgås. Den registrerede mindste fluorescens i denne mørktilpassede tilstand er beskrevet med parameteren Fo. Anvendelse af en højintensiv lyspuls på et mørkt tilpasset blad kan hurtigt reducere den første stabile elektronacceptorpulje af quinoner bundet til quinon A-stedet. Dette blokerer midlertidigt elektronoverførselskapacitet i PSII-reaktionscentre, som derefter siges at være lukkede og ude af stand til at modtage elektroner fra vandopdeling. Ved at bruge en kort pulsvarighed er der utilstrækkelig tid til at stimulere NPQ. Den resulterende klorofylfluorescens svarer til den maksimale værdi, der kan opnås i fravær af NPQ eller maksimal fluorescens, Fm. Forskellen mellem minimal og maksimal fluorescens kaldes variabel fluorescens, Fv. Det maksimale fotokemiske kvanteudbytte af fotosystem II (Fv/Fm) beregnes ud fra disse to parametre ved hjælp af følgende ligning:

Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm

Dette kan give en vigtig indikator for fotosystemfunktion og stress. Tænding af et aktinisk (fotosyntetisk) lys stimulerer ikke-fotokemisk slukning, og efterfølgende påføring af en mættende blitz muliggør måling af lystilpasset maksimal fluorescens, Fm ‘. Ved at sammenligne forskellen mellem mørk og lystilpasset maksimal fluorescens kan NPQ beregnes i henhold til Stern-Volmer ligningen10:

NPQ = Fm/Fm‘ – 1

I højere anlæg er NPQ blevet beskrevet som bestående af mindst fem forskellige komponenter, herunder qE, qT, qZ, qI og qH. De præcise mekanismer, der er involveret i NPQ, er ikke fuldt ud forstået; qE anses dog for at være hovedkomponenten i NPQ i de fleste anlæg. Afgørende faktorer for fuld engagement af qE har vist sig at omfatte opbygningen af en protongradient over thylakoidmembranen, aktiviteten af fotosystem II underenhed S11,12 og de-epoxiderede xanthophylls, antheraxanthin, lutein og især zeaxanthin13. qE slapper hurtigst af enhver NPQ-komponent (< 2 min)14, og reversibel aktivering af qE er derfor særlig vigtig for tilpasning til skiftende lysintensiteter. En anden langsommere fase af NPQ-afslapning (~ 2-30 min) omfatter både qT, relateret til tilstandsovergange, og qZ, der involverer interkonvertering af zeaxanthin til violaxanthin15. Langsom afslappende (> 30 min) NPQ kan omfatte både fotoinhibitory quenching (qI)16 og processer uafhængigt af fotoskade17,18, såsom qH, som er vedvarende slukning i de perifere antenner af PSII medieret af et plastid lipocalinprotein19,20.

NPQ øges under eksponering for højt lys. Efterfølgende overførsel til svagt lys kan resultere i nedregulering af NPQ. Henfaldet af hurtige, mellemliggende og langsomme afslappende faser kan fanges i parametrene for en bi-eksponentiel funktion 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

Det teoretiske grundlag for den bi-eksponentielle funktion er baseret på antagelsen om førsteordensudnyttelse af hypotetiske slukningsmidler, herunder qE (Aq1), den kombinerede afslapning af qZ og qT (Aq2) med de tilsvarende tidskonstanter τq1 og τq2 og langsigtet NPQ, som omfatter qI og fotoskadeuafhængige processer (Aq3). Som sådan giver den bi-eksponentielle funktion en mere realistisk repræsentation af de mange forbundne biologiske processer, der er involveret i at slukke klorofylfluorescens sammenlignet med en enklere Hill-ligning, der mangler et teoretisk grundlag24.

NPQ kan måles ved hjælp af en række kommercielt tilgængelige PAM-fluorometre25,26, fra enkle håndholdte enheder27 til mere avancerede lukkede systemer28. En begrænsning af flere af disse tilgange er imidlertid en relativt lav gennemstrømning, hvilket gør screening af store samlinger af planter udfordrende uden flere enheder og et team af forskere. For at løse dette problem udviklede McAusland et al. en procedure baseret på udskåret bladvæv og brugte den til at identificere forskelle i klorofylfluorescens mellem to hvedesorter29. Tiltrækningen ved denne tilgang er, at billeddannelse af bladskiver, taget fra flere planter med en enkelt enhed, kan lette screening af hundredvis af genotyper inden for en dag. Dette gør det muligt at vurdere variation i NPQ-afslapning som en del af genom brede associeringsundersøgelser eller til screening af avlspopulationer med potentiale til at øge afgrødens fotosyntetiske effektivitet og i sidste ende udbytte.

På baggrund af resultaterne fra McAusland et al.29 bruger vi PAM klorofylfluorescensanalyse af bladskiver til screening med høj kapacitet af NPQ-afslapningshastigheder i Glycine max (G.max; sojabønne). Denne protokol bruger CF Imager25, som kan sammenlignes med andre kommercielt tilgængelige lukkede PAM-systemer, såsom den populære FluorCam26. Med et mørkt rum til tilpasning af prøver kan brugerne afbilde 96-brøndplader, petriskåle og små planter. Den vigtigste fordel ved denne tilgang er stigningen i gennemstrømning ved at bruge bladskiver sammenlignet med sekventiel analyse af individuelle planter. Heri præsenterer vi repræsentative resultater og en metode til prøveudtagning, måling og analyse af NPQ i markdyrkede planter.

Protocol

1. Plantning af frø Vælg et marksted med frugtbar, veldrænet, men ikke sandjord og med en pH-værdi på næsten 6,5. Marker 1,2 m rækkeparceller med 0,75 m afstand ved at score jorden med en hakke. Plant 50 frø/m G.max cv. IA3023 i 3 cm dybde langs hver observationsgrund i begyndelsen af vækstsæsonen, når jordtemperaturen er mellem 25 og 30 °C.BEMÆRK: Med henblik på screening af genetisk mangfoldighed forventes det, at flere forskellige genotyper dyrkes og samm…

Representative Results

Figur 1A viser en typisk måling af NPQ i markdyrket sojabønne. Planter blev dyrket i Urbana, IL (breddegrad 40.084604 °, længdegrad -88.227952 °) i løbet af sommeren 2021, med frø plantet den 5. juni. 2021. Bladskiverne blev udtaget efter 30 dages plantning af frø, og der blev foretaget målinger med den angivne protokol (tabel 1). Fv/Fm – og NPQ-værdier blev beregnet for hver bladskive (supplerende tabel 4), og NPQ-afslapningspara…

Discussion

Omhyggelig valg og håndtering af bladskiver er afgørende for at opnå pålidelige målinger af NPQ. For det første vil skader på vævet, såsom grov håndtering med pincet, medføre stress, hvilket resulterer i lave værdier for den maksimale kvanteeffektivitet af fotosyntese. Ikke-stressede planter har typisk Fv/Fm-værdier på omkring 0,8318, med betydelige fald, der indikerer en reduktion i fotosyntetisk ydeevne9. Planter dyrke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af forskningsprojektet Realizing Increased Photosynthetic Efficiency (RIPE), der er finansieret af Bill &Melinda Gates Foundation, Foundation for Food and Agriculture Research og U.K. Foreign, Commonwealth &Development Office under tilskudsnummer OPP1172157.

Materials

24 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012929 Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012931 Country of Origin: United States of America
Aluminum foil Antylia Scientific  61018-56 Country of Origin: United States of America
Black marker pen Sharpie SAN30001 Country of Origin: United States of America
CF imager Technologica Ltd. N/A chlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm Humboldt Mfg Co H9665 Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software Technologica Ltd. N/A imaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters Amazon  B07P6XCTGV Country of Origin: United States of America
Marker stakes John Henry Company KN0151 Country of Origin: United States of America
Paper scissors VWR 82027-596 Country of Origin: United States of America
Parafilm Bemis Company Inc.  S3-594-6 Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers Fisher Scientific 14-130M Country of Origin: United States of America
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Tags

High-throughput AnalysisNon-photochemical QuenchingPulse Amplitude Modulated Chlorophyll FluorometryGenetic DiversitySoybeanLeaf Discs24-well Plate96-well PlateNasal Aspirator FilterHumidity
check_url/63485?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M., Hinkle, A., Kromdijk, J., Burgess, S. J. High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry. J. Vis. Exp. (185), e63485, doi:10.3791/63485 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image