Высокопроизводительный анализ нефотохимического закалки сельскохозяйственных культур с использованием флуорометрии с импульсно-амплитудной модуляцией хлорофилла
Summary
Протокол вводит высокопроизводительный метод измерения релаксации нефотохимического гашения импульсно-амплитудной флюорометрией хлорофилла. Метод применяется к выращиваемому в полевых условиях Glycine max и может быть адаптирован к другим видам для скрининга генетического разнообразия или размножающихся популяций.
Abstract
Фотосинтез не оптимизирован в современных сортах сельскохозяйственных культур, а потому дает возможность для улучшения. Ускорение релаксации нефотохимического закалки (NPQ) оказалось эффективной стратегией для повышения эффективности фотосинтеза. Тем не менее, потенциал для размножения для улучшения NPQ и полного понимания генетической основы релаксации NPQ отсутствует из-за ограничений перевыборки и сбора данных с растений, выращенных в полевых условиях. Основываясь на предыдущих отчетах, мы представляем высокопроизводительный анализ для анализа скорости релаксации NPQ в Glycine max (соя) с использованием флуорометрии хлорофилла с амплитудной амплитудой (PAM). Листовые диски отбираются из выращенных в полевых условиях соевых бобов перед транспортировкой в лабораторию, где релаксация NPQ измеряется в закрытом PAM-флуорометре. Параметры релаксации NPQ рассчитываются путем подгонки биэкспоненциальной функции к измеренным значениям NPQ после перехода от высокого к низкому освещению. Используя этот метод, можно протестировать сотни генотипов в течение дня. Эта процедура имеет потенциал для скрининга мутантных и разнообразных панелей на предмет вариаций в релаксации NPQ и, следовательно, может быть применена как к фундаментальным, так и к прикладным исследовательским вопросам.
Introduction
Фотосинтез состоит из поглощения света, переноса первичных электронов, стабилизации энергии, а также синтеза и переноса продуктов фотосинтеза1. Понимание каждого шага имеет жизненно важное значение для руководства усилиями по повышению эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур. Свет влияет на скорость фотосинтеза, требуя балансировки энергоснабжения, в виде фотонов, с потребностью в уменьшении эквивалентов. Когда предложение превышает спрос, например, при сильном освещении или во время пониженной фиксацииСО2 , вызванной закрытием устьичного устьица, накопление восстановительной мощности увеличивает вероятность образования активных форм кислорода с потенциалом повреждения фотосинтетического аппарата и нарушения переноса электронов. Поэтому для предотвращения повреждений растения разработали несколько фотозащитных механизмов, включая детоксикацию активных форм кислорода и нефотохимическое гашение возбужденных хлорофилловых состояний (NPQ)2.
Поддержание высоких темпов фотосинтеза является сложной задачей в полевых условиях. Сезонные и суточные изменения, наряду с колебаниями окружающей среды, такими как вызванные ветром движения листьев и переходный облачный покров, вызывают сдвиги в количестве и интенсивности света, получаемого растениями для фотосинтеза3. NPQ рассеивает избыточную световую энергию и может помочь предотвратить повреждение фотографий, обеспечивая при этом устойчивые темпы фотосинтеза при высоком освещении4. Однако длительный NPQ во время переходов с высокой на низкую освещенность продолжает рассеивать энергию, которая может быть использована для сокращения выбросов углерода5. В результате ускорение релаксации NPQ может повысить эффективность фотосинтеза6, что делает релаксацию NPQ привлекательной целью для улучшения урожая.
Анализ флуоресценции хлорофилла (PAM) с амплитудной амплитудой может быть использован для расчета NPQ по измеримым параметрам (Дополнительная таблица 1 и Дополнительная таблица 2)7,8,9. Эта статья посвящена определению скорости релаксации NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях, с целью скрининга естественной изменчивости зародышевой плазмы. Тем не менее, флюорометрический анализ PAM хлорофилла также может быть использован для широкого спектра целей, применен к видам, начиная от водорослей до высших растений, и рассматривается в других местах 7,8,9.
В адаптированном к темноте листе или ячейке реакционные центры фотосистемы II (PSII) открыты для приема электронов, и нет NPQ. Включение измерительного света низкой интенсивности вызывает флуоресценцию хлорофилла, избегая при этом переноса электронов через PSII. Регистрируемая минимальная флуоресценция в этом адаптированном к темноте состоянии описывается параметром Fo. Применение светового импульса высокой интенсивности к адаптированному к темноте листу может быстро уменьшить первый стабильный пул акцепторов электронов хинонов, связанных с сайтом хинона А. Это временно блокирует емкость переноса электронов в реакционных центрах PSII, которые затем, как говорят, закрыты и не могут принимать электроны от расщепления воды. При использовании короткой длительности импульса недостаточно времени для стимуляции NPQ. Результирующая флуоресценция хлорофилла эквивалентна максимальному значению, получаемому при отсутствии NPQ, или максимальной флуоресценции, Fm. Разница между минимальной и максимальной флуоресценцией называется переменной флуоресценцией, Fv. Максимальный фотохимический квантовый выход фотосистемы II (Fv/Fm) вычисляется из этих двух параметров с использованием следующего уравнения:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
Это может обеспечить важный показатель функции фотосистемы и напряжения. Включение актинического (фотосинтетического) света стимулирует нефотохимическое гашение, а последующее применение насыщенной вспышки позволяет измерить адаптированную к свету максимальную флуоресценцию, Fm‘. Сравнивая разницу между темной и адаптированной к свету максимальной флуоресценцией, NPQ можно рассчитать в соответствии с уравнением Штерна-Вольмера10:
NPQ = Fм/Fм‘ – 1
В высших растениях NPQ был описан как состоящий по меньшей мере из пяти различных компонентов, включая qE, qT, qZ, qI и qH. Точные механизмы, задействованные в НПК, до конца не изучены; однако qE считается основным компонентом NPQ на большинстве заводов. Было обнаружено, что решающие факторы для полного включения qE включают накопление протонного градиента через тилакоидную мембрану, активность субъединицы фотосистемы II S11,12 и деэпоксидированные ксантофиллы, антераксантин, лютеин и, в частности, зеаксантин13. qE расслабляет быстрее всех компонентов NPQ (< 2 мин)14, и поэтому обратимая активация qE особенно важна для адаптации к изменяющейся интенсивности света. Вторая более медленная фаза релаксации NPQ (~2-30 мин) охватывает как qT, связанный с переходами состояний, так и qZ, включающий взаимопревращение зеаксантина в виолаксантин15. Медленное расслабление (> 30 мин) NPQ может включать как фотоингибаторное закалку (qI)16, так и процессы, независимые от фотоповреждения 17,18, такие как qH, которое является устойчивым закалкой в периферических усиках PSII, опосредованным пластидным липокалиновым белком 19,20.
NPQ увеличивается во время воздействия высокого света. Последующий переход на слабый свет может привести к понижению регуляции NPQ. Распад быстрой, промежуточной и медленной фаз расслабления может быть уловлен в параметрах биэкспоненциальной функции 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Теоретическая основа биэкспоненциальной функции основана на предположении об использовании первого порядка гипотетических гасячей, включая qE (Aq1), комбинированную релаксацию qZ и qT (Aq2) с соответствующими временными константами τq1 и τq2 и долгосрочный NPQ, включающий qI и фотоповреждающие независимые процессы (Aq3). Таким образом, биэкспоненциальная функция обеспечивает более реалистичное представление множественных связанных биологических процессов, участвующих в гашении флуоресценции хлорофилла, по сравнению с более простым уравнением Хилла, которое не имеет теоретической основы24.
NPQ может быть измерен с использованием различных коммерчески доступных PAM флуорометров25,26, от простых ручных устройств27 до более совершенных закрытых систем28. Однако ограничением некоторых из этих подходов является относительно низкая пропускная способность, что делает скрининг больших коллекций растений сложным без нескольких устройств и команды исследователей. Для решения этой проблемы McAusland et al. разработали процедуру, основанную на иссеченной листовой ткани, и использовали ее для выявления различий в флуоресценции хлорофилла между двумя сортами пшеницы29. Привлекательность этого подхода заключается в том, что визуализация листовых дисков, взятых из нескольких растений с помощью одного устройства, может облегчить скрининг сотен генотипов в течение дня. Это позволяет оценить вариации в релаксации NPQ в рамках исследований геномных ассоциаций или для скрининга размножающихся популяций с потенциалом повышения эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур и, в конечном счете, урожайности.
Основываясь на результатах McAusland et al.29, мы используем флуоресцентный анализ флуоресценции ПАМ хлорофилла листовых дисков для высокопроизводительного скрининга скорости релаксации NPQ в Glycine max (G.max; соя). Этот протокол использует CF Imager25, который сопоставим с другими коммерчески доступными системами закрытого PAM, такими как популярная FluorCam26. С темной комнатой для адаптации образцов пользователи могут визуализировать 96-луночные тарелки, чашки Петри и небольшие растения. Ключевым преимуществом такого подхода является увеличение пропускной способности, обеспечиваемой использованием листовых дисков по сравнению с последовательным анализом отдельных растений. Здесь мы представляем репрезентативные результаты и метод отбора проб, измерения и анализа NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тщательный выбор и обращение с листовыми дисками имеют решающее значение для получения надежных измерений NPQ. Во-первых, повреждение ткани, такое как грубое обращение пинцетом, приведет к стрессу, что приведет к низким значениям максимальной квантовой эффективности фотосинтеза. Расте?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается исследовательским проектом «Реализация повышенной эффективности фотосинтеза» (RIPE), который финансируется Фондом Билла и Мелинды Гейтс, Фондом исследований в области продовольствия и сельского хозяйства и Управлением иностранных дел, содружества и развития Великобритании под номером гранта OPP1172157.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
References
- Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
- Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
