ניתוח בתפוקה גבוהה של מרווה לא פוטוכימית בגידולים באמצעות פלואורומטריית כלורופיל מווסתת משרעת פולסים
Summary
הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת הרפיה של מרווה לא פוטוכימית על ידי פלואורומטריה של כלורופיל מווסתת משרעת פולסים. השיטה מיושמת על גליצין מקס שגדל בשדה וניתן להתאים אותה למינים אחרים כדי לסנן מגוון גנטי או אוכלוסיות רבייה.
Abstract
הפוטוסינתזה אינה מותאמת לזני יבול מודרניים, ולכן מספקת הזדמנות לשיפור. האצת ההרפיה של מרווה לא פוטוכימית (NPQ) הוכיחה את עצמה כאסטרטגיה יעילה להגברת הביצועים הפוטוסינתזיים. עם זאת, הפוטנציאל להתרבות לשיפור ה-NPQ והבנה מלאה של הבסיס הגנטי של הרפיית NPQ לוקה בחסר בשל מגבלות של דגימת יתר ואיסוף נתונים מצמחי יבול שגדלו בשדה. בהתבסס על דיווחים קודמים, אנו מציגים בדיקה בתפוקה גבוהה לניתוח שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (סויה) באמצעות פלואורומטריה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM). דיסקי עלים נדגמים מפולי סויה שגודלו בשדה לפני הובלתם למעבדה שבה הרפיית NPQ נמדדת בפלואורומטר PAM סגור. פרמטרי הרפיית NPQ מחושבים על-ידי התאמת פונקציה דו-מעריכית לערכי NPQ הנמדדים לאחר מעבר מאור גבוה לתאורה נמוכה. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון מאות גנוטיפים בתוך יום. להליך יש פוטנציאל לסנן לוחות מוטציה וגיוון לשינויים בהרפיית NPQ, ולכן ניתן ליישם אותו הן בשאלות מחקר בסיסיות והן בשאלות מחקר יישומיות.
Introduction
הפוטוסינתזה מורכבת מבליעת אור, העברת אלקטרונים ראשונית, ייצוב אנרגיה וסינתזה והובלה של תוצרים פוטוסינתטיים1. הבנת כל שלב היא חיונית כדי להנחות את המאמצים להגברת היעילות הפוטוסינתזית של היבול. האור משפיע על קצב הפוטוסינתזה, ודורש איזון בין אספקת האנרגיה, בצורה של פוטונים, לבין הביקוש להפחתת שווה ערך. כאשר ההיצע עולה על הביקוש, למשל תחת תאורה גבוהה או במהלך קיבוע CO2 מופחת הנגרם על ידי סגירה סטומהטלית, הצטברות של הפחתת כוח מגדילה את ההסתברות להיווצרות מיני חמצן תגובתי עם פוטנציאל לפגוע במנגנון הפוטוסינתזה ולפגוע בהובלת אלקטרונים. לכן, כדי למנוע נזק, צמחים פיתחו מספר מנגנוני הגנה פוטו-מגנים, כולל ניקוי רעלים של מיני חמצן תגובתי ומרווה לא פוטוכימית של מצבי הכלורופיל הנרגשים (NPQ)2.
שמירה על שיעורים גבוהים של פוטוסינתזה היא מאתגרת בסביבת שדה. שינויים עונתיים ומשתנים, יחד עם תנודות סביבתיות כגון תנועות עלים הנגרמות על ידי הרוח וכיסוי עננים חולף, גורמים לשינויים בכמות האור ובעוצמת האור המתקבלים על ידי צמחים לצורך פוטוסינתזה3. NPQ מפזר אנרגיית אור עודפת ויכול לסייע במניעת נזקי צילום תוך שהוא מאפשר קצבים מתמשכים של פוטוסינתזה בתאורה גבוהה4. עם זאת, NPQ ממושך במהלך מעברים בתאורה גבוהה עד נמוכה ממשיך לפזר אנרגיה שיכולה לשמש להפחתת פחמן5. כתוצאה מכך, האצת ההרפיה של NPQ יכולה להגביר את היעילות של פוטוסינתזה6, מה שהופך את הרפיית NPQ ליעד אטרקטיבי לשיפור היבול.
ניתן להשתמש בניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל מווסת משרעת פולסים (PAM) כדי לחשב NPQ מפרמטרים הניתנים למדידה (טבלה משלימה 1 וטבלה משלימה 2)7,8,9. מאמר זה מתמקד בקביעת שיעורי הרפיית NPQ בצמחים הגדלים בשדה לצורך סינון השונות הטבעית בחיידק. עם זאת, ניתוח פלואורומטריה של PAM chlorophyll יכול לשמש גם למגוון רחב של מטרות, מיושם על מינים החל מאצות ועד צמחים גבוהים יותר, והוא נבדק במקום אחר 7,8,9.
בעלה או בתא מותאם כהה, מרכזי התגובה של מערכת הפוטו-מערכת II (PSII) פתוחים לקליטת אלקטרונים ואין NPQ. הפעלת אור מדידה בעוצמה נמוכה מעוררת פלואורסצנציה של כלורופיל תוך הימנעות מהובלת אלקטרונים דרך PSII. הפלואורסצנציה המינימלית שנרשמה במצב מותאם כהה זה מתוארת על ידי הפרמטר Fo. מריחת פולס אור בעוצמה גבוהה על עלה מותאם כהה יכולה להפחית במהירות את מאגר מקבל האלקטרונים היציב הראשון של קינון הקשור לאתר קינון A. זה חוסם באופן זמני את יכולת העברת האלקטרונים במרכזי התגובה של PSII, שאז אומרים שהם סגורים ואינם מסוגלים לקלוט אלקטרונים מפיצול מים. על ידי שימוש במשך דופק קצר, אין מספיק זמן כדי לעורר NPQ. הפלואורסצנציה הכלורופיל המתקבלת שקולה לערך המרבי המתקבל בהיעדר NPQ, או פלואורסצנציה מקסימלית, Fm. ההבדל בין פלואורסצנציה מינימלית למקסימום מכונה פלואורסצנציה משתנה, Fv. התפוקה הקוונטית הפוטוכימית המרבית של מערכת הפוטו-מערכת II (Fv/Fm) מחושבת משני הפרמטרים הללו באמצעות המשוואה הבאה:
Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm
זה יכול לספק אינדיקציה חשובה לתפקוד מערכת הצילום ולמתח. הפעלת אור אקטיני (פוטוסינתטי) מגרה מרווה לא פוטוכימית, ויישום מאוחר יותר של הבזק רווי מאפשר מדידה של פלואורסצנציה מקסימלית מותאמת אור, Fm‘. על ידי השוואת ההפרש בין פלואורסצנציה מקסימלית בחושך לבין פלואורסצנציה מקסימלית המותאמת לאור, ניתן לחשב את NPQ על פי משוואת שטרן-וולמר10:
NPQ = Fm/Fm‘ – 1
בצמחים גבוהים יותר, NPQ תואר כמורכב מלפחות חמישה רכיבים נפרדים, כולל qE, qT, qZ, qI ו- qH. המנגנונים המדויקים המעורבים ב- NPQ אינם מובנים במלואם; עם זאת, qE נחשב למרכיב העיקרי של NPQ ברוב הצמחים. גורמים מכריעים למעורבות מלאה של qE נמצאו כוללים הצטברות של שיפוע פרוטון על פני הממברנה התילאקואידית, פעילות של תת-יחידה II של מערכת פוטו-מערכת II S 11,12, וקסנתופילים דה-אפוקסידיים, אנתראקסנטין, לוטאין, ובמיוחד זאקסנטין13. qE מרגיע את המהיר ביותר מכל רכיב NPQ (< 2 דקות)14, ולכן הפעלה הפיכה של qE חשובה במיוחד להסתגלות לעוצמות אור משתנות. שלב שני איטי יותר של הרפיית NPQ (כ-2-30 דקות) מקיף הן את qT, הקשור למעברי מצב, והן את qZ, הכולל היפוך הדדי של זאקסנטין לוויולאקסנטין15. הרפיה איטית (> 30 דקות) של NPQ עשויה לכלול הן מרווה פוטואינהיביטורית (qI)16 והן תהליכים שאינם תלויים בפוטו-דיאמג’ 17,18, כגון qH, שהוא מרווה מתמשכת באנטנות ההיקפיות של PSII המתווכת על ידי חלבון ליפוקלין פלסטי19,20.
NPQ עולה במהלך החשיפה לאור גבוה. העברה לאחר מכן לתאורה חלשה עלולה לגרום להנמכת הרגולציה של NPQ. ניתן ללכוד את הדעיכה של שלבים מרגיעים מהירים, בינוניים ואיטיים בפרמטרים של פונקציה דו-מעריכית 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
הבסיס התיאורטי לפונקציה הדו-מעריכית מבוסס על ההנחה של ניצול מסדר ראשון של מרווה היפותטית, כולל qE (Aq1), הרפיה משולבת של qZ ו-qT (Aq2), עם קבועי הזמן המתאימים τq1 ו-τq2, ו-NPQ לטווח ארוך, הכולל qI ותהליכים בלתי תלויים בפוטו-דאמג’ (Aq3). ככזו, הפונקציה הדו-מעריכית מספקת ייצוג מציאותי יותר של התהליכים הביולוגיים המחוברים המרובים המעורבים בהרוות פלואורסצנציה של כלורופיל בהשוואה למשוואת היל פשוטה יותר, אשר חסרה בסיס תיאורטי24.
ניתן למדוד NPQ באמצעות מגוון פלואורומטרים PAM הזמינים מסחרית25,26, החל ממכשירים ידניים פשוטים27 ועד למערכות סגורות מתקדמות יותר28. עם זאת, מגבלה של כמה מהגישות הללו היא תפוקה נמוכה יחסית, מה שהופך את הסינון של אוספים גדולים של צמחים למאתגר ללא מכשירים מרובים וצוות חוקרים. כדי לטפל בבעיה זו, McAusland et al. פיתחו הליך המבוסס על רקמת עלה שנכרתה והשתמשו בה כדי לזהות הבדלים בפלואורסצנציה של כלורופיל בין שני גזעי חיטה29. המשיכה של גישה זו היא שהדמיית דיסקים של עלים, שנלקחו מצמחים מרובים באמצעות מכשיר אחד, יכולה להקל על סינון מאות גנוטיפים תוך יום. זה מאפשר להעריך שונות בהרפיית NPQ כחלק ממחקרי אסוציאציה רחבה של הגנום, או לסינון אוכלוסיות רבייה עם פוטנציאל להגביר את היעילות הפוטוסינתזית של היבולים ובסופו של דבר להניב תשואה.
בהתבסס על הממצאים של McAusland et al.29, אנו משתמשים בניתוח פלואורסצנטי של PAM כלורופיל של דיסקות עלים לצורך סינון בתפוקה גבוהה של שיעורי הרפיה של NPQ בגליצין מקסימום (G.max; סויה). פרוטוקול זה משתמש ב- CF Imager25, הדומה למערכות PAM סגורות אחרות הזמינות מסחרית, כגון FluorCam26 הפופולרי. עם חדר חשוך להתאמת דגימות, המשתמשים יכולים לדמות צלחות של 96 בארות, צלחות פטרי וצמחים קטנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא הגידול בתפוקה המוענקת על ידי שימוש בדיסקות עלים בהשוואה לניתוח רציף של צמחים בודדים. כאן אנו מציגים תוצאות מייצגות, ושיטה לדגימה, מדידה וניתוח של NPQ בצמחים הגדלים בשדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחירה וטיפול זהירים בדיסקי עלים הם קריטיים להשגת מדידות אמינות של NPQ. ראשית, נזק לרקמה, כגון טיפול גס בפינצטה, יגרום ללחץ, וכתוצאה מכך יהיו ערכים נמוכים ליעילות הקוונטית המרבית של הפוטוסינתזה. לצמחים שאינם לחוצים יש בדרך כלל ערכי Fv/Fm של כ-0.8318, כאשר ירידות מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר מימוש יעילות פוטוסינתטית מוגברת (RIPE) הממומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס, הקרן לחקר מזון וחקלאות, ומשרד החוץ, חבר העמים הבריטי והפיתוח תחת מספר מענק OPP1172157.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
References
- Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
- Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
