Analisi ad alto rendimento della tempra non fotochimica nelle colture utilizzando la fluorometria clorofilla modulata con ampiezza di impulso

Summary

Il protocollo introduce un metodo ad alto rendimento per misurare il rilassamento della tempra non fotochimica mediante fluorometria clorofilliana modulata in ampiezza di impulso. Il metodo viene applicato alla glicina max coltivata sul campo e può essere adattato ad altre specie per lo screening della diversità genetica o delle popolazioni riproduttive.

Abstract

La fotosintesi non è ottimizzata nelle moderne varietà di colture e quindi offre un’opportunità di miglioramento. Accelerare il rilassamento della tempra non fotochimica (NPQ) si è dimostrata una strategia efficace per aumentare le prestazioni fotosintetiche. Tuttavia, il potenziale di riproduzione per migliorare NPQ e una comprensione completa delle basi genetiche del rilassamento NPQ è carente a causa delle limitazioni del sovracampionamento e della raccolta di dati da piante coltivate in campo. Sulla base di rapporti precedenti, presentiamo un test ad alto rendimento per l’analisi dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (soia) utilizzando la fluorometria clorofilliana modulata dall’ampiezza dell’impulso (PAM). I dischi fogliari vengono campionati da semi di soia coltivati in campo prima del trasporto in un laboratorio dove il rilassamento NPQ viene misurato in un fluorometro PAM chiuso. I parametri di rilassamento NPQ sono calcolati adattando una funzione bie-esponenziale ai valori NPQ misurati a seguito di una transizione da alta a bassa illuminazione. Utilizzando questo metodo, è possibile testare centinaia di genotipi in un giorno. La procedura ha il potenziale per schermare i pannelli mutanti e di diversità per la variazione nel rilassamento NPQ e può quindi essere applicata a domande di ricerca sia fondamentali che applicate.

Introduction

La fotosintesi consiste nell’assorbimento della luce, nel trasferimento di elettroni primari, nella stabilizzazione dell’energia e nella sintesi e trasporto di prodotti fotosintetici¹. Comprendere ogni passaggio è fondamentale per guidare gli sforzi per aumentare l’efficienza fotosintetica delle colture. La luce influenza il tasso di fotosintesi, richiedendo un apporto energetico di bilanciamento, sotto forma di fotoni, con la domanda di equivalenti riducenti. Quando l’offerta supera la domanda, ad esempio in condizioni di luce intensa o durante la ridotta fissazione di CO₂ causata dalla chiusura stomatica, l’accumulo di potenza riducente aumenta la probabilità di formazione di specie reattive dell’ossigeno con il potenziale di danneggiare l’apparato fotosintetico e compromettere il trasporto di elettroni. Pertanto, per prevenire danni, le piante hanno sviluppato diversi meccanismi fotoprotettivi, tra cui la disintossicazione delle specie reattive dell’ossigeno e la tempra non fotochimica degli stati eccitati della clorofilla (NPQ)².

Mantenere alti tassi di fotosintesi è difficile in un ambiente di campo. I cambiamenti stagionali e diurni, insieme alle fluttuazioni ambientali come i movimenti fogliari indotti dal vento e la copertura nuvolosa transitoria, causano cambiamenti nella quantità e nell’intensità della luce ricevuta dalle piante per la fotosintesi³. NPQ dissipa l’energia luminosa in eccesso e può aiutare a prevenire i foto-danni, consentendo al contempo tassi sostenuti di fotosintesi ad alta luminosità⁴. Tuttavia, l’NPQ prolungato durante le transizioni da alta a bassa illuminazione continua a dissipare l’energia che potrebbe essere utilizzata per la riduzione del carbonio⁵. Di conseguenza, accelerare il rilassamento di NPQ può aumentare l’efficienza della fotosintesi⁶, rendendo il rilassamento NPQ un obiettivo attraente per il miglioramento delle colture.

L’analisi di fluorescenza della clorofilla modulata in ampiezza di impulso (PAM) può essere utilizzata per calcolare NPQ da parametri misurabili (Tabella supplementare 1 e Tabella supplementare 2)^7,8,9. Questo articolo si concentra sulla determinazione dei tassi di rilassamento NPQ nelle piante coltivate sul campo allo scopo di vagliare la variazione naturale del germoplasma. Tuttavia, l’analisi fluorometrica della clorofilla PAM può anche essere utilizzata per un’ampia varietà di scopi, applicata a specie che vanno dalle alghe alle piante superiori, ed è rivista altrove ^7,8,9.

In una foglia o cellula adattata al buio, i centri di reazione del fotosistema II (PSII) sono aperti per ricevere elettroni e non c’è NPQ. L’accensione di una luce di misurazione a bassa intensità provoca la fluorescenza della clorofilla evitando il trasporto di elettroni attraverso PSII. La fluorescenza minima registrata in questo stato adattato al buio è descritta dal parametro F_o. L’applicazione di un impulso luminoso ad alta intensità a una foglia adattata al buio può ridurre rapidamente il primo pool stabile di accettori di elettroni legati al sito A del chinone. Questo blocca temporaneamente la capacità di trasferimento di elettroni nei centri di reazione PSII, che si dice siano chiusi e incapaci di ricevere elettroni dalla scissione dell’acqua. Utilizzando una breve durata dell’impulso, non c’è tempo sufficiente per stimolare NPQ. La fluorescenza della clorofilla risultante è equivalente al valore massimo ottenibile in assenza di NPQ, o fluorescenza massima, F_m. La differenza tra fluorescenza minima e massima è indicata come fluorescenza variabile, F_v. La resa quantistica fotochimica massima del fotosistema II (F_v/F_m) è calcolata da questi due parametri utilizzando la seguente equazione:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Questo può fornire un importante indicatore della funzione del fotosistema e dello stress. L’accensione di una luce attinica (fotosintetica) stimola la tempra non fotochimica e la successiva applicazione di un flash saturante consente la misurazione della fluorescenza massima adattata alla luce, F_m‘. Confrontando la differenza tra fluorescenza massima scura e adattata alla luce, nPQ può essere calcolato secondo l’equazione di Stern-Volmer¹⁰:

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

Negli impianti superiori, nPQ è stato descritto come costituito da almeno cinque componenti distinti, tra cui qE, qT, qZ, qI e qH. I meccanismi precisi coinvolti nella NPQ non sono completamente compresi; tuttavia, il qE è considerato il componente principale di NPQ nella maggior parte degli impianti. Fattori cruciali per il pieno coinvolgimento della qE sono stati trovati per includere l’accumulo di un gradiente protonico attraverso la membrana tilacoide, l’attività della subunità S^11,12 del fotosistema II e le xantofille de-epossidate, l’antheraxanthin, la luteina e in particolare la zeaxantina¹³. qE rilassa il più veloce di qualsiasi componente NPQ (< 2 min)¹⁴, e l’attivazione reversibile del qE è quindi particolarmente importante per l’adattamento alle intensità della luce mutevoli. Una seconda fase più lenta del rilassamento NPQ (~2-30 min) comprende sia qT, correlata alle transizioni di stato, sia qZ, che coinvolge l’interconversione della zeaxantina in violaxantina¹⁵. Il rilassamento lento (> 30 min) di NPQ può includere sia la tempra fotoinibitoria (qI)¹⁶ che processi indipendenti dal fotodanno^17,18, come il qH, che è una tempra sostenuta nelle antenne periferiche di PSII mediata da una proteina lipocalina plastide^19,20.

NPQ aumenta durante l’esposizione alla luce intensa. Il successivo trasferimento in condizioni di scarsa illuminazione può comportare una downregulation di NPQ. Il decadimento delle fasi di rilassamento veloce, intermedio e lento può essere catturato nei parametri di una funzione biemi esponenziale 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

La base teorica per la funzione bi-esponenziale si basa sull’assunzione dell’utilizzo del primo ordine di ipotetici quecher, tra cui qE (Aq1), il rilassamento combinato di qZ e qT (Aq2), con le corrispondenti costanti temporali τq1 e τq2, e NPQ a lungo termine, che include qI e processi indipendenti dal fotodanno (Aq3). Come tale, la funzione bi-esponenziale fornisce una rappresentazione più realistica dei molteplici processi biologici connessi coinvolti nella tempra della clorofilla rispetto a una più semplice equazione di Hill che manca di una base teorica²⁴.

NPQ può essere misurato utilizzando una varietà di fluorometri PAM disponibili in commercio ^25,26, dai semplici dispositivi portatili²⁷ ai sistemi chiusi più avanzati²⁸. Tuttavia, una limitazione di molti di questi approcci è un throughput relativamente basso, che rende difficile lo screening di grandi collezioni di piante senza più dispositivi e un team di ricercatori. Per affrontare questo problema, McAusland et al. hanno sviluppato una procedura basata sul tessuto fogliare asportato e l’hanno utilizzata per identificare le differenze nella fluorescenza della clorofilla tra due cultivar di grano²⁹. L’attrazione di questo approccio è che l’imaging dei dischi fogliari, prelevati da più piante con un singolo dispositivo, può facilitare lo screening di centinaia di genotipi in un giorno. Ciò consente di valutare la variazione nel rilassamento NPQ come parte di studi di associazione a livello di genoma o per lo screening di popolazioni riproduttive con il potenziale per aumentare l’efficienza fotosintetica delle colture e, in definitiva, la resa.

Basandoci sui risultati di McAusland et ^al.29, utilizziamo l’analisi di fluorescenza della clorofilla PAM dei dischi fogliari per lo screening ad alto rendimento dei tassi di rilassamento NPQ in Glycine max (G.max; soia). Questo protocollo utilizza il CF Imager²⁵, che è paragonabile ad altri sistemi PAM chiusi disponibili in commercio, come il popolare FluorCam²⁶. Con una stanza buia per l’adattamento dei campioni, gli utenti possono visualizzare piatti a 96 pozzetti, piastre di Petri e piccole piante. Il vantaggio principale di questo approccio è l’aumento della produttività offerto dall’utilizzo di dischi fogliari rispetto all’analisi sequenziale dei singoli impianti. Qui presentiamo risultati rappresentativi e un metodo per il campionamento, la misurazione e l’analisi di NPQ in piante coltivate sul campo.

Protocol

1. Semina Scegli un sito sul campo con terreno fertile, ben drenato, ma non sabbioso e con un pH di quasi 6,5. Segna i lotti di fila da 1,2 m con una spaziatura di 0,75 m segnando il terreno con una zappa. Piantare 50 semi/m di G.max cv. IA3023 a 3 cm di profondità lungo ogni appezzamento all’inizio della stagione di crescita quando le temperature del suolo sono comprese tra 25 e 30 °C.NOTA: Ai fini dello screening della diversità genetica, si prevede che vengano colti…

Representative Results

La Figura 1A illustra una misura tipica di NPQ nella soia coltivata in campo. Le piante sono state coltivate a Urbana, IL (latitudine 40.084604°, longitudine -88.227952°) durante l’estate 2021, con semi piantati il 5 giugno. 2021. I dischi fogliari sono stati campionati dopo 30 giorni di semina e le misurazioni sono state effettuate con il protocollo fornito (Tabella 1). I valori Fv/Fm e NPQ sono stati calcolati per ciascun disco fogliare (Tabella…

Discussion

La scelta accurata e la gestione dei dischi fogliari sono fondamentali per ottenere misurazioni affidabili di NPQ. In primo luogo, i danni al tessuto, come la manipolazione approssimativa con una pinzetta, introdurranno stress, con conseguenti valori bassi per la massima efficienza quantistica della fotosintesi. Le piante non stressate hanno tipicamente valori F_v/F_m di circa 0,83¹⁸, con cali significativi che indicano una riduzione delle prestazioni fotosint…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America