تحليل عالي الإنتاجية للتبريد غير الكيميائي الضوئي في المحاصيل باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض
Summary
يقدم البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية لقياس استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي عن طريق قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل بسعة النبض. يتم تطبيق هذه الطريقة على الجلايسين ماكس المزروع في الحقل ويمكن تكييفه مع الأنواع الأخرى للكشف عن التنوع الوراثي أو مجموعات التكاثر.
Abstract
لا يتم تحسين التمثيل الضوئي في أصناف المحاصيل الحديثة ، وبالتالي يوفر فرصة للتحسين. لقد أثبت تسريع استرخاء التبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQ) أنه استراتيجية فعالة لزيادة أداء التمثيل الضوئي. ومع ذلك ، فإن القدرة على التكاثر من أجل تحسين NPQ والفهم الكامل للأساس الجيني لتخفيف NPQ غير موجودة بسبب القيود المفروضة على أخذ العينات الزائدة وجمع البيانات من نباتات المحاصيل المزروعة في الحقول. بناء على التقارير السابقة ، نقدم مقايسة عالية الإنتاجية لتحليل معدلات استرخاء NPQ في Glycine max (فول الصويا) باستخدام قياس فلوروفيل الكلوروفيل المعدل لسعة النبض (PAM). يتم أخذ عينات من أقراص الأوراق من فول الصويا المزروع في الحقل قبل نقله إلى المختبر حيث يتم قياس استرخاء NPQ في مقياس فلورومتر PAM مغلق. يتم حساب معلمات استرخاء NPQ عن طريق تركيب دالة ثنائية الأس لقيم NPQ المقاسة بعد الانتقال من الإضاءة العالية إلى الإضاءة المنخفضة. باستخدام هذه الطريقة ، من الممكن اختبار مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. هذا الإجراء لديه القدرة على فحص لوحات الطفرات والتنوع بحثا عن التباين في استرخاء NPQ ، وبالتالي يمكن تطبيقه على كل من أسئلة البحث الأساسية والتطبيقية.
Introduction
يتكون التمثيل الضوئي من امتصاص الضوء ، ونقل الإلكترون الأولي ، وتثبيت الطاقة ، وتوليف ونقل منتجات التمثيل الضوئي1. يعد فهم كل خطوة أمرا حيويا لتوجيه الجهود الرامية إلى زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل. يؤثر الضوء على معدل التمثيل الضوئي ، مما يتطلب موازنة إمدادات الطاقة ، في شكل فوتونات ، مع الطلب على تقليل المعادلات. عندما يتجاوز العرض الطلب ، على سبيل المثال تحت الضوء العالي أو أثناء انخفاض تثبيت CO2 الناجم عن إغلاق الفم ، فإن تراكم الطاقة المخفضة يزيد من احتمال تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية مع إمكانية إتلاف جهاز التمثيل الضوئي وإضعاف نقل الإلكترون. لذلك ، لمنع الضرر ، طورت النباتات العديد من آليات الحماية الضوئية ، بما في ذلك إزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية والتبريد غير الكيميائي الضوئي لحالات الكلوروفيل المثارة (NPQ)2.
الحفاظ على معدلات عالية من التمثيل الضوئي أمر صعب في ظل بيئة ميدانية. التغيرات الموسمية والنهارية ، إلى جانب التقلبات البيئية مثل حركات الأوراق التي تسببها الرياح والغطاء السحابي العابر ، تسبب تحولات في كمية وشدة الضوء الذي تتلقاه النباتات لعملية التمثيل الضوئي3. يبدد NPQ الطاقة الضوئية الزائدة ويمكن أن يساعد في منع تلف الصور مع السماح بمعدلات مستدامة من التمثيل الضوئي عند الإضاءة العالية4. ومع ذلك ، فإن NPQ المطول أثناء التحولات في الإضاءة العالية إلى المنخفضة يستمر في تبديد الطاقة التي يمكن استخدامها للحد من الكربون5. ونتيجة لذلك ، فإن تسريع استرخاء NPQ يمكن أن يزيد من كفاءة التمثيل الضوئي6 ، مما يجعل استرخاء NPQ هدفا جذابا لتحسين المحاصيل.
يمكن استخدام تحليل فلورة الكلوروفيل المعدلة بسعة النبض (PAM) لحساب NPQ من المعلمات القابلة للقياس (الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2)7،8،9. تركز هذه المقالة على تحديد معدلات استرخاء NPQ في النباتات المزروعة في الحقول لغرض فحص التباين الطبيعي في البلازما الجرثومية. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام تحليل قياس فلوروفيل الكلوروفيل PAM لمجموعة واسعة من الأغراض ، وتطبيقه على الأنواع التي تتراوح من الطحالب إلى النباتات الأعلى ، ويتم مراجعته في مكان آخر 7,8,9.
في ورقة أو خلية متكيفة مع الظلام ، تكون مراكز تفاعل النظام الضوئي II (PSII) مفتوحة لاستقبال الإلكترونات ولا يوجد NPQ. يؤدي تشغيل ضوء قياس منخفض الكثافة إلى استثارة فلورة الكلوروفيل مع تجنب نقل الإلكترون عبر PSII. يتم وصف الحد الأدنى من التألق المسجل في هذه الحالة المظلمة المتكيفة بواسطة المعلمة Fo. إن تطبيق نبضة ضوئية عالية الكثافة على ورقة متكيفة مع الظلام يمكن أن يقلل بسرعة من أول تجمع مستقر لمستقبل الإلكترون من الكينونات المرتبطة بموقع الكينون أ. هذا يمنع مؤقتا قدرة نقل الإلكترون في مراكز تفاعل PSII ، والتي يقال بعد ذلك إنها مغلقة وغير قادرة على استقبال الإلكترونات من تقسيم الماء. باستخدام مدة نبض قصيرة ، لا يوجد وقت كاف لتحفيز NPQ. ويعادل تألق الكلوروفيل الناتج القيمة القصوى التي يمكن الحصول عليها في غياب NPQ أو الحد الأقصى للتألق Fm. يشار إلى الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى من التألق باسم التألق المتغير ، Fv. يتم حساب الحد الأقصى للعائد الكمومي الكيميائي الضوئي للنظام الضوئي II (F v/Fm) من هاتين المعلمتين باستخدام المعادلة التالية:
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
هذا يمكن أن يوفر مؤشرا مهما لوظيفة النظام الضوئي والإجهاد. يؤدي تشغيل ضوء أكتينيك (photoyntic) إلى تحفيز التبريد غير الكيميائي الضوئي ، ويسمح التطبيق اللاحق للفلاش المشبع بقياس التألق الأقصى المتكيف مع الضوء ، Fm‘. من خلال مقارنة الفرق بين التألق الأقصى للضوء والظلام المتكيف مع الضوء ، يمكن حساب NPQ وفقا لمعادلة Stern-Volmer10:
NPQ = F m/Fm‘ – 1
في المصانع العليا ، تم وصف NPQ بأنه يتكون من خمسة مكونات متميزة على الأقل ، بما في ذلك qE و qT و qZ و qI و qH. والآليات الدقيقة التي ينطوي عليها الإطار الوطني للرصد ليست مفهومة تماما؛ ومع ذلك ، يعتبر qE المكون الرئيسي ل NPQ في معظم النباتات. وقد وجد أن العوامل الحاسمة للمشاركة الكاملة ل qE تشمل تراكم تدرج البروتون عبر غشاء الثايلاكويد ، ونشاط الوحدة الفرعية للنظام الضوئي II S11,12 ، و xanthophylls de-epoxided ، antheraxanthin ، lutein ، وعلى وجه الخصوص zeaxanthin13. يرتاح qE بشكل أسرع من أي مكون من مكونات NPQ (< 2 دقيقة)14 ، وبالتالي فإن التنشيط العكسي ل qE مهم بشكل خاص للتكيف مع شدة الضوء المتغيرة. تشمل المرحلة الثانية الأبطأ من استرخاء NPQ (~ 2-30 دقيقة) كلا من qT ، المتعلقة بانتقالات الحالة ، و qZ ، التي تنطوي على التحويل البيني للزياكسانثين إلى violaxanthin15. قد يشمل الاسترخاء البطيء (> 30 دقيقة) من NPQ كلا من التبريد المثبط للضوء (qI)16 والعمليات المستقلة عن الضرر الضوئي17,18 ، مثل qH ، الذي يستمر في التبريد في الهوائيات الطرفية ل PSII بوساطة بروتين ليبوكالين البلاستيد 19,20.
يزداد NPQ أثناء التعرض للضوء العالي. يمكن أن يؤدي النقل اللاحق إلى الإضاءة المنخفضة إلى خفض تنظيم NPQ. يمكن التقاط اضمحلال مراحل الاسترخاء السريعة والمتوسطة والبطيئة في معلمات الدالة ثنائية الأس 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
يعتمد الأساس النظري للدالة ثنائية الأس على افتراض الاستخدام من الدرجة الأولى للمروي الافتراضي ، بما في ذلك qE (Aq1) ، والاسترخاء المشترك ل qZ و qT (Aq2) ، مع الثوابت الزمنية المقابلة τq1 و τq2 ، و NPQ طويل الأجل ، والذي يتضمن عمليات مستقلة للضرر الضوئي (Aq3). على هذا النحو ، توفر الدالة ثنائية الأس تمثيلا أكثر واقعية للعمليات البيولوجية المتعددة المتصلة المشاركة في إخماد فلورة الكلوروفيل مقارنة بمعادلة هيل الأبسط التي تفتقر إلى الأساس النظري24.
يمكن قياس NPQ باستخدام مجموعة متنوعة من مقاييس الفلورومتر PAM المتاحة تجاريا 25,26 ، من الأجهزة المحمولة باليد البسيطة27 إلى الأنظمة المغلقة الأكثر تقدما28. ومع ذلك ، فإن الحد من العديد من هذه الأساليب هو الإنتاجية المنخفضة نسبيا ، مما يجعل فحص مجموعات كبيرة من النباتات أمرا صعبا بدون أجهزة متعددة وفريق من الباحثين. ولمعالجة هذه المسألة، طور ماكاوسلاند وآخرون إجراء يستند إلى أنسجة الأوراق المستثناة واستخدموه لتحديد الاختلافات في تألق الكلوروفيل بين صنفين من القمح29. وتكمن جاذبية هذا النهج في أن تصوير أقراص الأوراق، المأخوذة من نباتات متعددة بجهاز واحد، يمكن أن يسهل فحص مئات الأنماط الجينية في غضون يوم واحد. وهذا يجعل من الممكن تقييم التباين في استرخاء NPQ كجزء من دراسات الارتباط على نطاق الجينوم ، أو لفحص مجموعات التكاثر مع إمكانية زيادة كفاءة التمثيل الضوئي للمحاصيل والعائد في نهاية المطاف.
بناء على نتائج McAusland et al.29 ، نستخدم تحليل تألق الكلوروفيل PAM لأقراص الأوراق للفحص عالي الإنتاجية لمعدلات استرخاء NPQ في Glycine max (G.max ؛ فول الصويا). يستخدم هذا البروتوكول CF Imager25 ، والذي يمكن مقارنته بأنظمة PAM المغلقة الأخرى المتاحة تجاريا ، مثل FluorCam26 الشهير. مع غرفة مظلمة لتكييف العينات ، يمكن للمستخدمين تصوير 96 لوحة جيدة ، وأطباق بتري ، ونباتات صغيرة. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي الزيادة في الإنتاجية التي يوفرها استخدام أقراص الأوراق مقارنة بالتحليل المتسلسل للنباتات الفردية. نقدم هنا نتائج تمثيلية ، وطريقة لأخذ العينات وقياسها وتحليلها من NPQ في النباتات المزروعة في الحقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الاختيار الدقيق لأقراص الأوراق والتعامل معها أمرا بالغ الأهمية للحصول على قياسات موثوقة ل NPQ. أولا ، سيؤدي تلف الأنسجة ، مثل التعامل الخشن مع الملقط ، إلى الإجهاد ، مما يؤدي إلى قيم منخفضة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الكمومية لعملية التمثيل الضوئي. عادة ما يكون للنباتات غير المجهدة قيم F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال المشروع البحثي تحقيق زيادة كفاءة التمثيل الضوئي (RIPE) الذي تموله مؤسسة بيل وميليندا غيتس ، ومؤسسة أبحاث الأغذية والزراعة ، ومكتب الخارجية والكومنولث والتنمية في المملكة المتحدة تحت رقم المنحة OPP1172157.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
References
- Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
- Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
