Analys med hög genomströmning av icke-fotokemisk släckning i grödor med hjälp av pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri

Summary

Protokollet introducerar en högkapacitetsmetod för att mäta avslappningen av icke-fotokemisk släckning genom pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri. Metoden tillämpas på fältodlad Glycine max och kan anpassas till andra arter för att screena för genetisk mångfald eller avelspopulationer.

Abstract

Fotosyntesen är inte optimerad i moderna grödor och ger därför möjlighet till förbättring. Att påskynda avslappningen av icke-fotokemisk släckning (NPQ) har visat sig vara en effektiv strategi för att öka fotosyntetisk prestanda. Potentialen att avla för förbättrad NPQ och en fullständig förståelse för den genetiska grunden för NPQ-avslappning saknas dock på grund av begränsningar av översampling och datainsamling från fältodlade grödor. Baserat på tidigare rapporter presenterar vi en analys med hög genomströmning för analys av NPQ-avslappningshastigheter i glycin max (sojabönor) med hjälp av pulsamplitudmodulerad (PAM) klorofyllfluorometri. Bladskivor provtas från fältodlade sojabönor före transport till ett laboratorium där NPQ-avslappning mäts i en sluten PAM-fluorometer. NPQ-avslappningsparametrar beräknas genom att anpassa en bi-exponentiell funktion till de uppmätta NPQ-värdena efter en övergång från högt till svagt ljus. Med hjälp av denna metod är det möjligt att testa hundratals genotyper inom en dag. Förfarandet har potential att screena mutant- och mångfaldspaneler för variation i NPQ-avslappning, och kan därför tillämpas på både grundläggande och tillämpade forskningsfrågor.

Introduction

Fotosyntes består av ljusabsorption, primär elektronöverföring, energistabilisering, och syntes och transport av fotosyntetiska produkter¹. Att förstå varje steg är avgörande för att vägleda ansträngningarna för att öka grödans fotosyntetiska effektivitet. Ljus påverkar fotosynteshastigheten, vilket kräver balansering av energiförsörjning, i form av fotoner, med efterfrågan på att minska ekvivalenter. När utbudet överstiger efterfrågan, till exempel under högt ljus eller under reducerad CO_2-fixering orsakad av stomatal stängning, ökar uppbyggnaden av reducerande effekt sannolikheten för reaktiv syreartbildning med potential att skada den fotosyntetiska apparaten och försämra elektrontransporten. För att förhindra skador har växter därför utvecklat flera fotoskyddsmekanismer, inklusive avgiftning av reaktiva syrearter och icke-fotokemisk släckning av de exciterade klorofylltillstånden (NPQ)².

Att upprätthålla höga fotosynteshastigheter är utmanande under en fältmiljö. Säsongs- och dygnsförändringar, tillsammans med miljöfluktuationer som vindinducerade bladrörelser och övergående molntäcke, orsakar förändringar i mängden och intensiteten av ljus som tas emot av växter för fotosyntes³. NPQ sprider överflödig ljusenergi och kan hjälpa till att förhindra fotoskador samtidigt som det möjliggör ihållande fotosynteshastigheter vid högt ljus⁴. Långvarig NPQ under övergångar i högt till svagt ljus fortsätter dock att sprida energi som kan användas för koldioxidreduktion⁵. Som ett resultat kan påskynda avslappningen av NPQ öka effektiviteten i^{fotosyntesen 6}, vilket gör NPQ-avkoppling till ett attraktivt mål för förbättring av grödor.

Pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorescensanalys (PAM) kan användas för att beräkna NPQ från mätbara parametrar (tilläggstabell 1 och tilläggstabell 2)^7,8,9. Denna artikel fokuserar på att bestämma NPQ-avslappningshastigheter i fältodlade växter i syfte att screena naturlig variation i bakterieplasma. PAM-klorofyllfluorometrianalys kan dock också användas för en mängd olika ändamål, tillämpas på arter som sträcker sig från alger till högre växter och granskas någon annanstans ^7,8,9.

I ett mörkanpassat blad eller cell är reaktionscentra för fotosystem II (PSII) öppna för att ta emot elektroner och det finns ingen NPQ. Att slå på ett lågintensivt mätljus framkallar klorofyllfluorescens samtidigt som elektrontransport genom PSII undviks. Den registrerade minsta fluorescensen i detta mörkanpassade tillstånd beskrivs med parametern F_o. Att applicera en högintensiv ljuspuls på ett mörkanpassat blad kan snabbt minska den första stabila elektronacceptorpoolen av kinoner bundna till kinon A-platsen. Detta blockerar tillfälligt elektronöverföringskapacitet i PSII-reaktionscentra, som sedan sägs vara stängda och inte kan ta emot elektroner från vattendelning. Genom att använda en kort pulsvaraktighet finns det inte tillräckligt med tid för att stimulera NPQ. Den resulterande klorofyllfluorescensen motsvarar det maximala värdet som kan erhållas i frånvaro av NPQ, eller maximal fluorescens, F_m. Skillnaden mellan minimal och maximal fluorescens kallas variabel fluorescens, F_v. Det maximala fotokemiska kvantutbytet för fotosystem II (F_v/F_m) beräknas utifrån dessa två parametrar med hjälp av följande ekvation:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Detta kan ge en viktig indikator på fotosystemets funktion och stress. Att slå på ett aktiniskt (fotosyntetiskt) ljus stimulerar icke-fotokemisk släckning, och efterföljande applicering av en mättande blixt möjliggör mätning av ljusanpassad maximal fluorescens, F_m ‘. Genom att jämföra skillnaden mellan mörk och ljusanpassad maximal fluorescens kan NPQ beräknas enligt Stern-Volmer-ekvationen¹⁰:

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

I högre anläggningar har NPQ beskrivits bestå av minst fem distinkta komponenter, inklusive qE, qT, qZ, qI och qH. De exakta mekanismerna för npq är inte helt klarlagda. qE anses dock vara huvudkomponenten i NPQ i de flesta anläggningar. Avgörande faktorer för fullt engagemang av qE har visat sig inkludera uppbyggnaden av en protongradient över tylakoidmembranet, aktiviteten hos fotosystem II-underenheten S ^11,12 och de-epoxiderade xantofyller, antheraxantin, lutein och i synnerhet zeaxantin¹³. qE slappnar av snabbast av alla NPQ-komponenter (< 2 min)¹⁴, och reversibel aktivering av qE är därför särskilt viktig för anpassning till skiftande ljusintensiteter. En andra långsammare fas av NPQ-avslappning (~ 2-30 min) omfattar både qT, relaterade till tillståndsövergångar, och qZ, som involverar interkonversion av zeaxantin till violaxantin¹⁵. Långsam avslappnande (> 30 min) av NPQ kan innefatta både fotoinhibitorisk släckning (qI)¹⁶ och processer oberoende av fotoskada^17,18, såsom qH, som upprätthålls släckning i de perifera antennerna av PSII medierad av ett plastidlipokalinprotein^19,20.

NPQ ökar under exponering för högt ljus. Efterföljande överföring till svagt ljus kan leda till nedreglering av NPQ. Sönderfallet av snabba, mellanliggande och långsamma avslappnande faser kan fångas i parametrarna för en bi-exponentiell funktion 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

Den teoretiska grunden för den bi-exponentiella funktionen är baserad på antagandet om första ordningens användning av hypotetiska släckare, inklusive qE (Aq1), den kombinerade avslappningen av qZ och qT (Aq2), med motsvarande tidskonstanter τq1 och τq2, och långsiktig NPQ, som inkluderar qI och fotoskadande oberoende processer (Aq3). Som sådan ger den bi-exponentiella funktionen en mer realistisk representation av de flera anslutna biologiska processerna som är involverade i att släcka klorofyllfluorescens jämfört med en enklare Hill-ekvation som saknar en teoretisk grund²⁴.

NPQ kan mätas med hjälp av en mängd kommersiellt tillgängliga PAM-fluorometrar^25,26, från enkla handhållna enheter²⁷ till mer avancerade slutna system²⁸. En begränsning av flera av dessa metoder är dock en relativt låg genomströmning, vilket gör screening av stora samlingar av växter utmanande utan flera enheter och ett team av forskare. för att ta itu med denna fråga utvecklade McAusland m.fl. ett förfarande baserat på utskuren bladvävnad och använde det för att identifiera skillnader i klorofyllfluorescens mellan två vetesorter²⁹. Attraktionen med detta tillvägagångssätt är att avbildning av bladskivor, tagna från flera växter med en enda enhet, kan underlätta screening av hundratals genotyper inom en dag. Detta gör det möjligt att bedöma variationen i NPQ-avslappning som en del av genomomfattande associeringsstudier, eller för screening av avelspopulationer med potential att öka grödans fotosyntetiska effektivitet och i slutändan ge.

Baserat på resultaten från McAusland et ^al.29 använder vi PAM klorofyllfluorescensanalys av bladskivor för screening med hög genomströmning av NPQ-avslappningshastigheter i Glycine max (G.max; sojabönor). Detta protokoll använder CF Imager²⁵, vilket är jämförbart med andra kommersiellt tillgängliga slutna PAM-system, till exempel den populära FluorCam²⁶. Med ett mörkt rum för anpassning av prover kan användare avbilda 96-brunnsplattor, petriskålar och små växter. Den viktigaste fördelen med detta tillvägagångssätt är den ökade genomströmningen som erbjuds genom att använda bladskivor jämfört med sekventiell analys av enskilda växter. Här presenterar vi representativa resultat och en metod för provtagning, mätning och analys av NPQ i fältodlade växter.

Protocol

1. Frö plantering Välj en fältplats med bördig, väldränerad men inte sandjord och med ett pH på nästan 6,5. Markera 1,2 m rad tomter med 0,75 m avstånd genom att göra marken med en hacka. Plantera 50 frön/m G.max cv. IA3023 på 3 cm djup längs varje område i början av växtsäsongen när jordtemperaturen är mellan 25 och 30 °C.OBS: För screening av genetisk mångfald förväntas flera olika genotyper odlas och jämföras. Plantera 2-5 rader per genotyp ar…

Representative Results

Figur 1A visar en typisk mätning av NPQ i fältodlad sojaböna. Växter odlades i Urbana, IL (latitud 40.084604 °, longitud -88.227952 °) under sommaren 2021, med frön planterade den 5 juni. 2021. Bladskivorna provtogs efter 30 dagars plantering av frön, och mätningar gjordes med det tillhandahållna protokollet (tabell 1). Fv/Fm – och NPQ-värden beräknades för varje bladskiva (tilläggstabell 4) och NPQ-avslappningsparametrar ber?…

Discussion

Noggrann val och hantering av bladskivor är avgörande för att få tillförlitliga mätningar av NPQ. För det första kommer skador på vävnaden, såsom grov hantering med pincett, att införa stress, vilket resulterar i låga värden för maximal kvanteffektivitet för fotosyntes. Icke-stressade växter har vanligtvis F_v / F_m-värden på cirka 0,83¹⁸, med signifikanta nedgångar som indikerar en minskning av fotosyntetisk prestanda^9</s…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America