Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Yana Lerner; Surya Sukumaran; Mei-Sze Chua; Samuel K. So; Nir Qvit

doi:10.3791/63495

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Изучение биомолекулярного взаимодействия между молекулярным шапероном Hsp90 и его клиентской протеинкиназой Cdc37 с использованием технологии полевого биозондирования

Published: March 31, 2022

doi:

10.3791/63495

Yana Lerner*¹, Surya Sukumaran*¹, Mei-Sze Chua, Samuel K. So, Nir Qvit

¹The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee,Bar-Ilan University, ²Asian Liver Center, Department of Surgery,Stanford University School of Medicine

Summary

Полевое биозондирование (FEB) – это метод обнаружения биомолекулярных взаимодействий без меток. Он измеряет электрический ток через графеновый биосенсор, к которому иммобилизованы связывающие мишени. Технология FEB использовалась для оценки биомолекулярных взаимодействий между Hsp90 и Cdc37, и было обнаружено сильное взаимодействие между двумя белками.

Abstract

Биомолекулярные взаимодействия играют разностороннюю роль в многочисленных клеточных процессах, регулируя и координируя функционально значимые биологические события. Биомолекулы, такие как белки, углеводы, витамины, жирные кислоты, нуклеиновые кислоты и ферменты, являются фундаментальными строительными блоками живых существ; они объединяются в сложные сети в биосистемах, чтобы синхронизировать мириады жизненных событий. Белки обычно используют сложные интерактомные сети для выполнения своих функций; следовательно, необходимо оценить такие взаимодействия, чтобы разгадать их важность в клетках как на клеточном, так и на уровне организма. Для достижения этой цели мы внедряем быстро развивающуюся технологию полевого биозондирования (FEB) для определения конкретных биомолекулярных взаимодействий. FEB – это настольный, без маркировки и надежный метод биомолекулярного обнаружения для определения конкретных взаимодействий и использует высококачественные электронные биосенсоры. Технология FEB может контролировать взаимодействия в наномолярном диапазоне благодаря биосовместимым наноматериалам, используемым на поверхности биосенсора. В качестве доказательства концепции было выяснено белково-белковое взаимодействие (PPI) между белком теплового шока 90 (Hsp90) и циклом деления клеток 37 (Cdc37). Hsp90 является АТФ-зависимым молекулярным шапероном, который играет важную роль в сворачивании, стабильности, созревании и контроле качества многих белков, тем самым регулируя множество жизненно важных клеточных функций. Cdc37 рассматривается как специфический для протеинкиназы молекулярный шаперон, поскольку он специально распознает и рекрутирует протеинкиназы в Hsp90 для регулирования их последующих путей передачи сигнала. Таким образом, Cdc37 считается со-шапероном Hsp90. Путь шаперон-киназы (комплекс Hsp90/Cdc37) гиперактивирован при множественных злокачественных новообразованиях, способствующих клеточному росту; поэтому он является потенциальной мишенью для терапии рака. Настоящее исследование демонстрирует эффективность технологии FEB с использованием модельной системы Hsp90/Cdc37. FEB обнаружил сильный PPI между двумя белками (значения K_D 0,014 мкМ, 0,053 мкМ и 0,072 мкМ в трех независимых экспериментах). Таким образом, FEB – это платформа обнаружения PPI без меток и экономичная платформа, которая предлагает быстрые и точные измерения.

Introduction

Биомолекулярные взаимодействия:
Белки являются неотъемлемой частью организмов и участвуют в многочисленных молекулярных путях, таких как клеточный метаболизм, клеточная структура, клеточная сигнализация, иммунные реакции, клеточная адгезия и многое другое. В то время как некоторые белки выполняют свою функцию (функции) независимо, большинство белков взаимодействуют с другими белками, используя связующий интерфейс для координации надлежащей биологической активности¹.

Биомолекулярные взаимодействия могут быть в основном классифицированы на основе различных структурных и функциональных характеристик вовлеченных белков², например, на основе белковых поверхностей, комплексной стабильности или персистенции взаимодействий³. Идентификация основных белков и их роли в биомолекулярных взаимодействиях имеет жизненно важное значение для понимания биохимических механизмов на молекулярном уровне⁴. В настоящее время существуют различные подходы к обнаружению этих взаимодействий⁵: in vitro⁶, in silico⁷, в живых клетках⁸, ex vivo⁹ и in vivo¹⁰, причем каждый из них имеет свои сильные и слабые стороны.

Анализы in vivo выполняются с использованием всего животного в качестве экспериментального инструмента¹¹, а анализыt he ex vivo выполняются на экстрактах тканей или целых органов (например, сердце, мозг, печень) в контролируемой внешней среде, обеспечивая минимальные изменения в естественных условиях. Наиболее распространенным применением исследований in vivo и ex vivo является оценка фармакокинетики, фармакодинамики и токсичности потенциальных фармакологических агентов до испытаний на людях путем обеспечения их общей безопасности и эффективности¹².

Биомолекулярные взаимодействия также могут быть обнаружены в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать динамические взаимодействия, поскольку они выполняют реакции определенного биохимического пути¹³. Кроме того, методы обнаружения, такие как биолюминесценция или флуоресцентный резонансный перенос энергии, могут предоставить информацию о том, где и когда эти взаимодействия происходят в клетке¹⁴. Хотя обнаружение в живых клетках предлагает важные детали, эти методологии обнаружения основаны на оптике и метках, которые могут не отражать нативную биологию; они также менее контролируемы, чем методы in vitro , и требуют специализированных знаний для выполнения¹⁵.

Вычислительные методы in silico в основном используются для крупномасштабного скрининга молекул-мишеней перед экспериментами in vitro . Вычислительные методы прогнозирования, компьютерные базы данных, молекулярная стыковка, количественные отношения структура-активность и другие подходы к моделированию молекулярной динамики являются одними из хорошо зарекомендовавших себя инструментов in silico ¹⁶. По сравнению с трудоемкими экспериментальными методами, инструменты in silico могут легко делать прогнозы с высокой чувствительностью, но с пониженной точностью в прогностической производительности¹⁷.

Анализы in vitro проводятся с микроорганизмами или биологическими молекулами вне их стандартного биологического контекста. Изображение биомолекулярных взаимодействий с помощью методов in vitro имеет решающее значение для понимания функций белка и биологии, стоящей за сложной сетью функционирования клеток. Предпочтительная методология анализа выбирается в соответствии с внутренними свойствами белка, кинетическими значениями, а также режимом и интенсивностью взаимодействий^18,19.

Взаимодействие Hsp90/Cdc37:
Путь шаперон-киназы, соединяющий Hsp90 и Cdc37, является перспективной терапевтической мишенью в биологии опухоли²⁰. Hsp90 играет центральную роль в контроле клеточного цикла, сборке белка, выживании клеток и сигнальных путях. Белки, которые полагаются на Hsp90 для своих функций, доставляются в Hsp90 для комплексообразования через ко-шаперон, такой как Cdc37. Комплекс Hsp90/Cdc37 контролирует сворачивание большинства протеинкиназ и служит концентратором для множества внутриклеточных сигнальных сетей²¹. Это многообещающая противоопухолевая мишень из-за ее повышенной экспрессии при различных злокачественных новообразованиях, включая острый миелобластный лейкоз, множественную миелому и гепатоцеллюлярную карциному^22,23.

Широко используемые методы обнаружения биомолекулярного взаимодействия in vitro
Коиммунопреципитация (co-IP) представляет собой метод, основанный на специфичности антиген-антитело для идентификации биологически значимых взаимодействий²⁴. Основным недостатком этого метода является его неспособность обнаруживать низкоаффинные взаимодействия и кинетические значения²⁴. Биофизические методы, такие как изотермическая титрующая калориметрия (ITC), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и технология FEB, являются предпочтительными для определения кинетических значений.

ITC представляет собой биофизический метод обнаружения, основанный на определении энергии связывания наряду с полным термодинамическим анализом для характеристики биомолекулярных взаимодействий²⁵. Основным преимуществом ITC является то, что он не требует какой-либо маркировки или фиксации целевого белка. Основными трудностями, с которыми сталкивается ITC, являются высокая концентрация целевого белка, необходимого для одного эксперимента, и сложность анализа нековалентных комплексов из-за небольших энтальпий^{связывания 26}. Как SPR, так и BLI являются биофизическими методами без меток, которые полагаются на иммобилизацию молекулы-мишени на поверхности датчика с последующими инъекциями аналита через иммобилизованную мишень^27,28. В SPR измеряются изменения показателя преломления при биомолекулярных взаимодействиях²⁷; в BLI интерференция в отраженном свете регистрируется в режиме реального времени как изменение длины волны в зависимости от времени²⁸. Как SPR, так и BLI имеют общие преимущества, заключающиеся в высокой специфичности, чувствительности и возможностях обнаружения²⁹. В обоих способах белок-мишень иммобилизуется на биосенсорных поверхностях, и, следовательно, может произойти некоторая потеря нативной конформации мишени, что затрудняет различие между конкретными и неспецифическими взаимодействиями³⁰. BLI использует дорогостоящие одноразовые волоконно-оптические биосенсоры для иммобилизации мишени и, следовательно, является дорогостоящим методом³¹. По сравнению с этими хорошо зарекомендовавшими себя инструментами биомолекулярного обнаружения, технология FEB предлагает надежную и свободную от этикеток платформу, используя низкие наномолярные концентрации для биомолекулярного обнаружения в режиме реального времени с кинетической характеристикой. Технология FEB также преодолевает проблемы, с которыми сталкивается ITC, и является более экономически эффективной по сравнению с SPR или BLI.

Биосенсоры на основе полевых транзисторов (FET) являются новой областью для обнаружения биомолекулярных взаимодействий, предлагая различные биомедицинские приложения. В системе FET мишени иммобилизуются в микросхемы биосенсора, а взаимодействия обнаруживаются изменениями проводимости³². Уникальной особенностью, которую следует учитывать при разработке эффективного электронного биосенсора, являются физико-химические свойства, такие как полупроводниковая природа и химическая стабильность материала покрытия, используемого для изготовления поверхности^{датчика 33}. Обычные материалы, такие как кремний, используемые для FET, ограничивают чувствительность датчиков, поскольку для правильного функционирования требуются оксидные слои, зажатые между транзисторным каналом и определенной средой³⁴. Кроме того, кремниевые транзисторы чувствительны к средам с высоким содержанием соли, что затрудняет измерение биологических взаимодействий в их естественной среде. Биосенсор на основе графена представлен в качестве альтернативы, поскольку он обеспечивает отличную химическую стабильность и электрическое поле. Поскольку графен представляет собой единый атомный слой углерода, он чрезвычайно чувствителен как полупроводник и химически совместим с биологическими растворами; оба эти качества желательны для генерации совместимых электронных биосенсоров³⁵. Замечательный сверхвысокий нагрузочный потенциал биомолекул, предлагаемых биосенсорами с графеновым покрытием, приводит к разработке технологии биосенсоров FEB на основе графена.

Принцип технологии FEB: FEB – это метод биомолекулярного обнаружения без меток, который измеряет электрический ток через графеновый биосенсор, к которому иммобилизуются связывающие мишени. Взаимодействия между иммобилизованным белком и анализируемым веществом приводят к изменениям тока, которые контролируются в режиме реального времени, что позволяет проводить точные кинетические измерения³⁶.

Контрольно-измерительные приборы: Система FEB содержит графеновый полевой транзистор (gFET) сенсорный чип и электронный считыватель, который подает постоянное напряжение на протяжении всего эксперимента (рисунок 1). Аналит наносят в растворе на целевой белок, иммобилизованный на поверхности биосенсора. Когда происходит взаимодействие, изменение тока измеряется и записывается в режиме реального времени. По мере увеличения концентрации анализируемого вещества доля связанного аналита также будет увеличиваться, вызывая более высокие чередования в токе. С помощью автоматизированного аналитического программного обеспечения, поставляемого с прибором (Таблица материалов), I-Response измеряется и регистрируется в единицах биозондирования (BU)³⁷. I-Response определяется как изменение тока (I) через чип биосенсора, измеренное в режиме реального времени при взаимодействии иммобилизованной мишени с анализируемым веществом. Программное обеспечение для автоматизированного анализа FEB может анализировать как I-Response, так и C-Response на события динамического взаимодействия, где C-Response регистрирует изменения емкости (C). Вариации как i-response, так и C-Response непосредственно соответствуют доле связанного аналита и могут быть дополнительно проанализированы для получения значений K_D . Программное обеспечение для автоматизированного анализа по умолчанию предпочитает I-Response.

Рисунок 1: Обзор экспериментальной установки. (A) Чип на основе графена и электронный считыватель. (B) Обзор компонентов микросхемы. Чип прикреплен к двум электродам, которые подают ток в систему. Поверхность чипа покрыта графеном, который при активации может связывать мишень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Методология:
Первоначально активированный микросхема биосенсора вставляется в устройство FEB (рисунок 1) с последующим выполнением шагов, описанных ниже: (1) Калибровка: Эксперимент начинается с калибровки системы с использованием 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS; pH = 7,4) для создания базового ответа равновесия. (2) Ассоциация: Анализируемый элемент вводится в чип, и I-Response контролируется до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение связывания. (3) Диссоциация: анализируемый материал диссоциируется с использованием 1x PBS. (4) Регенерация: Остатки анализируемого вещества удаляются с использованием 1x PBS. (5) Стирка: В общей сложности пять стирок выполняются с использованием 1x PBS для тщательного удаления связанных и несвязанных аналитов из чипа.

Анализ:
Анализ данных выполняется с использованием полностью автоматизированного программного обеспечения, поставляемого с прибором. Автоматизированное аналитическое программное обеспечение генерирует график Hill fit со значением K_D . График соответствия Хилла описывает связь анализируемого вещества с целевым белком в зависимости от концентраций анализируемого вещества. Концентрация, при которой достигается полумаксимальный отклик, пропорциональна значению K_D . Низкое значение K_D представляет собой высокое сродство связывания и наоборот.

Для проверки данных, полученных в ходе эксперимента FEB, I-Ответы извлекаются из каждой точки считывания для каждой концентрации анализируемого вещества с использованием программного обеспечения для анализа/экспорта данных и могут быть экспортированы в другое программное обеспечение для статистического анализа (см. Таблицу материалов), как описано ниже.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки, используемые в этом исследовании, Hsp90 и Cdc37, были коммерчески получены (см. Таблицу материалов). 1. Активация чипа ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, которые будут использоваться в эксперименте, перечислены в Та…

Representative Results

Результаты эксперимента 1:Целевой белок Hsp90 (500 нМ) иммобилизовали в чип в соответствии с протоколом иммобилизации мишени, как описано выше. Для первого эксперимента 10 концентраций анализируемого белка Cdc37, в диапазоне от 25 нМ до 5000 нМ, были подготовлены на основе данных, имеющ?…

Discussion

В этом исследовании была оценена возможность использования технологии FEB (подход кинетической характеристики в реальном времени) для определения биомолекулярного взаимодействия между Hsp90 и Cdc37. Первоначальный исследовательский эксперимент (первый эксперимент) показал, что выбор прав…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантом Бинационального научного фонда (BSF) S.K.S. и N.Q.

Materials

Automated analysis software	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	biosensor chip
Data review software	Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag	CelluSep, Membrane filtration products	T2-10-15 CAS number: NA	T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)	Cardea (Nanomed)	EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8	White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system	Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)	NA CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer	Merck	M3671-50G CAS number: 4432-31-9	White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips	Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10	Bio-Lab	001623237500 CAS number: 7758-11-4	Liquid transparent solution
Pipete	Thermo Scientific	11855231 CAS number: NA	Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)	Cardea (Nanomed)	0105-001-002-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))	Cardea (Nanomed)	0105-001-003-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37	Abcam	ab256157 CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta	Abcam	ab80033 CAS number: NA
Spreadsheet	Excel, Microsoft office	NA CAS number: NA
Statistical software	GraphPad, Prism	NA CAS number: NA	Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS	Cardea (Nanomed)	NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7	White powder
Tips	Alex red	LC 1093-800-000 CAS number: NA	Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs

References

Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -. A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083 (2018).
Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
Qvit, N., Disatnik, M. -. H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438 (2014).
Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213 (2020).
Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), 213-221 (1999).
Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , 79-95 (2019).
Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882 (2014).
Vu, C. -. A., Chen, W. -. Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214 (2019).
Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434 (2019).
Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era…? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Lerner, Y., Sukumaran, S., Chua, M., So, S. K., Qvit, N. Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology. J. Vis. Exp. (181), e63495, doi:10.3791/63495 (2022).