Utforske biomolekylær interaksjon mellom molekylær chaperone Hsp90 og dets klientprotein Kinase Cdc37 ved hjelp av field-effect biosensing teknologi

Summary

Field-effect biosensing (FEB) er en etikettfri teknikk for å oppdage biomolekylære interaksjoner. Den måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. FEB-teknologien ble brukt til å evaluere biomolekylære interaksjoner mellom Hsp90 og Cdc37, og det ble påvist et sterkt samspill mellom de to proteinene.

Abstract

Biomolekylære interaksjoner spiller allsidige roller i en rekke cellulære prosesser ved å regulere og koordinere funksjonelt relevante biologiske hendelser. Biomolekyler som proteiner, karbohydrater, vitaminer, fettsyrer, nukleinsyrer og enzymer er grunnleggende byggesteiner i levende vesener; de samles i komplekse nettverk i biosystemer for å synkronisere et utall livshendelser. Proteiner bruker vanligvis komplekse interaktivitetsnettverk for å utføre sine funksjoner; Derfor er det obligatorisk å evaluere slike interaksjoner for å avdekke deres betydning i celler på både cellulære og organismenivåer. Mot dette målet introduserer vi en raskt fremvoksende teknologi, felteffekt biosensing (FEB), for å bestemme spesifikke biomolekylære interaksjoner. FEB er en stasjonær, etikettfri og pålitelig biomolekylær deteksjonsteknikk for å bestemme spesifikke interaksjoner og bruker elektroniske biosensorer av høy kvalitet. FEB-teknologien kan overvåke interaksjoner i nanomolarområdet på grunn av de biokompatible nanomaterialene som brukes på biosensoroverflaten. Som et konseptbevis ble proteinproteininteraksjonen (PPI) mellom varmesjokkprotein 90 (Hsp90) og celledelingssyklus 37 (Cdc37) belyst. Hsp90 er en ATP-avhengig molekylær anstand som spiller en viktig rolle i folding, stabilitet, modning og kvalitetskontroll av mange proteiner, og dermed regulerer flere vitale cellulære funksjoner. Cdc37 regnes som en protein kinase-spesifikk molekylær anstand, som det spesifikt anerkjenner og rekrutterer protein kinases til Hsp90 for å regulere deres nedstrøms signaltransduksjonsveier. Som sådan regnes Cdc37 som en med-anstand av Hsp90. Chaperone-kinase-banen (Hsp90/Cdc37-komplekset) er hyperaktivert i flere maligniteter som fremmer cellulær vekst; Derfor er det et potensielt mål for kreftbehandling. Den nåværende studien viser effektiviteten til FEB-teknologi ved hjelp av Hsp90 / Cdc37-modellsystemet. FEB oppdaget en sterk PPI mellom de to proteinene (K_D-verdier på 0,014 μM, 0,053 μM og 0,072 μM i tre uavhengige eksperimenter). Oppsummert er FEB en etikettfri og kostnadseffektiv PPI-deteksjonsplattform, som tilbyr raske og nøyaktige målinger.

Introduction

Biomolekylære interaksjoner:
Proteiner er essensielle deler av organismer og deltar i mange molekylære veier som cellemetabolisme, cellestruktur, cellesignalering, immunresponser, celleadhesjon og mer. Mens noen proteiner utfører sin funksjon (er) uavhengig, samhandler de fleste proteiner med andre proteiner ved hjelp av et bindende grensesnitt for å koordinere riktig biologisk aktivitet¹.

Biomolekylære interaksjoner kan hovedsakelig klassifiseres basert på de distinkte strukturelle og funksjonelle egenskapene til proteiner involvert², for eksempel basert på proteinoverflatene, den komplekse stabiliteten eller utholdenheten til interaksjoner³. Identifisering av essensielle proteiner og deres roller i biomolekylære interaksjoner er avgjørende for å forstå biokjemiske mekanismer på molekylærnivå⁴. For tiden er det forskjellige tilnærminger for å oppdage disse interaksjonene⁵: in vitro⁶, i silico⁷, i levende celler⁸, ex vivo⁹ og in vivo¹⁰ med hver har sine egne styrker og svakheter.

In vivo-analysene utføres ved hjelp av hele dyret som et eksperimentelt verktøy¹¹, oghan eks vivo-analyser utføres på vevsekstrakter eller hele organer (f.eks. hjerte, hjerne, lever) i et kontrollert eksternt miljø ved å gi minimale endringer i naturlige forhold. Den vanligste anvendelsen av in vivo– og ex vivo-studier er å evaluere farmakokinetikk, farmakodynamikk og toksisitetseffekter av potensielle farmakologiske midler før menneskelige studier ved å sikre deres generelle sikkerhet og effekt¹².

Biomolekylære interaksjoner kan også påvises i levende celler. Imaging levende celler tillater oss å observere dynamiske interaksjoner som de utfører reaksjonene av en bestemt biokjemisk vei¹³. Videre kan deteksjonsteknikker, for eksempel bioluminescens eller fluorescensresonansenergioverføring, gi informasjon om hvor og når disse interaksjonene skjer i celle¹⁴. Selv om deteksjon i levende celler gir viktige detaljer, er disse deteksjonsmetodene avhengige av optikk og etiketter, noe som kanskje ikke gjenspeiler den opprinnelige biologien; de er også mindre kontrollerte enn in vitro-metoder og krever spesialisert kompetanse for å utføre¹⁵.

I silico beregningsmetoder brukes primært til storskala screening av målmolekyler før in vitro-forsøkene. Beregningsmessige prediksjonsmetoder, databaserte databaser, molekylær dokking, kvantitative strukturaktivitetsrelasjoner og andre molekylære dynamikksimuleringsmetoder er blant de veletablerte i silicoverktøy ¹⁶. Sammenlignet med arbeidskrevende eksperimentelle teknikker, kan in silico-verktøyene enkelt gjøre spådommer med høy følsomhet, men med redusert nøyaktighet i prediktiv ytelse¹⁷.

In vitro-analyser utføres med mikroorganismer eller biologiske molekyler utenfor deres standard biologiske kontekst. Skildring av biomolekylære interaksjoner gjennom in vitro-metoder er avgjørende for å forstå proteinfunksjoner og biologien bak det komplekse nettverket av cellefunksjon. Den foretrukne analysemetodikken velges i henhold til proteinets iboende egenskaper, kinetiske verdier og modusen og intensiteten av interaksjoner ^18,19.

Hsp90/Cdc37-interaksjonen:
Chaperone-kinase-banen, som forbinder Hsp90 og Cdc37, er et lovende terapeutisk mål i tumorbiologi²⁰. Hsp90 spiller en sentral rolle i cellesykluskontroll, proteinmontering, celleoverlevelse og signalveier. Proteiner som er avhengige av Hsp90 for deres funksjoner, leveres til Hsp90 for kompleksitet gjennom en medprest, for eksempel Cdc37. Hsp90/Cdc37-komplekset styrer foldingen av de fleste proteinkinaser og fungerer som et knutepunkt for en rekke intracellulære signalnettverk²¹. Det er et lovende anti-tumor mål på grunn av sin forhøyede uttrykk i ulike maligniteter, inkludert akutt myeloblastisk leukemi, multippel myeloma, og hepatocellulært karsinom^22,23.

Vanlige in vitro biomolekylære interaksjonsdeteksjonsteknikker
Co-immunoprecipitation (co-IP) er en teknikk som er avhengig av antigen-antistoff spesifisitet for å identifisere biologisk relevante interaksjoner²⁴. Den største ulempen ved denne metoden er dens manglende evne til å oppdage interaksjoner med lav affinitet og kinetiske verdier²⁴. Biofysiske metoder som isotermisk titreringskalorimetri (ITC), overflateplasmonresonans (SPR), biolayer interferometri (BLI) og FEB-teknologi foretrekkes for å bestemme kinetiske verdier.

ITC er en biofysisk deteksjonsmetode basert på bestemmelse av bindende energi sammen med en komplett termodynamikkanalyse for å karakterisere biomolekylære interaksjoner²⁵. Den viktigste fordelen med ITC er at det ikke krever merking eller fiksering av målproteinet. De viktigste vanskelighetene som ITC møter er den høye konsentrasjonen av målprotein som kreves for ett eksperiment og vanskeligheten med å analysere ikke-kovalente komplekser på grunn av små bindende entalpier²⁶. Både SPR og BLI er etikettfrie biofysiske teknikker som er avhengige av immobilisering av målmolekylet på sensoroverflaten, etterfulgt av påfølgende injeksjoner av analytten over det immobiliserte målet^27,28. I SPR måles endringer i brytningsindeksen under biomolekylære interaksjoner²⁷; I BLI registreres interferensen i reflektert lys i sanntid som en endring i bølgelengden som en funksjon av tid²⁸. Både SPR og BLI deler felles fordeler ved å tilby høy spesifisitet, følsomhet og deteksjonsevne²⁹. I begge metoder er målproteinet immobilisert på biosensoroverflater, og derfor kan det være noe tap av målets opprinnelige konformasjon, noe som gjør det vanskelig å diskriminere mellom spesifikke kontra ikke-spesifikke interaksjoner³⁰. BLI bruker dyre engangs fiberoptiske biosensorer for å immobilisere målet, og er derfor en kostbar teknikk³¹. Sammenlignet med disse veletablerte biomolekylære deteksjonsverktøyene, tilbyr FEB-teknologi en pålitelig og etikettfri plattform ved å bruke lave nanomolarkonsentrasjoner for biomolekylær deteksjon i sanntid med kinetisk karakterisering. FEB-teknologien overvinner også de boblende utfordringene i ITC og er mer kostnadseffektiv sammenlignet med SPR eller BLI.

Den felteffekttransistor (FET) basert biosensorer er et fremvoksende felt for å oppdage biomolekylære interaksjoner ved å tilby varierte biomedisinske applikasjoner. I FET-systemet blir mål immobilisert til biosensorbrikkene og interaksjoner oppdages ved endringer i ledning³². Den unike egenskapen som skal vurderes i utviklingen av en effektiv elektronisk biosensor er de fysisk-kjemiske egenskapene som den halvledende naturen og kjemisk stabilitet av beleggmaterialet som brukes til å fremstille sensoroverflaten³³. Konvensjonelle materialer som silisium som brukes til FET har begrenset følsomheten til sensorer fordi det krever oksidlag smurt mellom transistorkanalen og et spesifikt miljø for riktig funksjon³⁴. Videre er silisiumtransistorer følsomme for høye saltmiljøer, noe som gjør det vanskelig å måle biologiske interaksjoner i sitt naturlige miljø. Den grafenbaserte biosensoren presenteres som et alternativ, da den tilbyr utmerket kjemisk stabilitet og elektrisk felt. Siden grafen er et enkelt atomlag av karbon, er det både ekstremt følsomt som en halvleder og kjemisk kompatibel med biologiske løsninger; begge disse egenskapene er ønskelige å generere kompatible elektroniske biosensorer³⁵. Det bemerkelsesverdige ultrahøye lastepotensialet til biomolekyler som tilbys av grafenbelagte biosensorer fører til utvikling av grafenbaserte biosensorer FEB-teknologi.

Prinsipp for FEB-teknologi: FEB er en etikettfri biomolekylær deteksjonsteknikk som måler den elektriske strømmen gjennom grafenbiosensoren som bindingsmålene immobiliseres til. Interaksjoner mellom det immobiliserte proteinet og analytten resulterer i endringer i strøm som overvåkes i sanntid, noe som muliggjør nøyaktige kinetiske målinger³⁶.

Instrumentering: FEB-systemet består av en grafenfelteffekttransistorsensor (gFET) og en elektronisk leser som bruker konstant spenning gjennom hele eksperimentet (figur 1). Analytten påføres i løsning på målproteinet immobilisert på biosensoroverflaten. Når en interaksjon oppstår, måles og registreres en endring i strømmen i sanntid. Etter hvert som analyttkonsentrasjonen øker, vil brøkdelen av bundet analytt også øke, noe som forårsaker høyere vekslinger i strømmen. Ved hjelp av den automatiserte analyseprogramvaren som følger med instrumentet (Materialfortegnelse), måles og registreres I-Response når det gjelder biosensing-enheter (BU)³⁷. I-Response er definert som endringen i den nåværende (I) gjennom biosensorbrikken målt i sanntid etter samspillet mellom det immobiliserte målet med analytten. Feb automatisert analyse programvare kan analysere både I-Response og C-Response til dynamiske interaksjon hendelser, der C-Response registrerer endringene i kapasitans (C). Variasjonene i både I-Response og C-Response samsvarer direkte med brøkdelen av bundet analytt og kan analyseres ytterligere for å generere K_D-verdier . Standardinnstillingen for den automatiserte analyseprogramvaren er I-Response.

Figur 1: Oversikt over det eksperimentelle oppsettet. (A) Grafenbasert brikke og en elektronisk leser. (B) En oversikt over brikkekomponentene. Brikken er festet til to elektroder som leverer strøm til systemet. Overflaten på brikken er dekket med grafen, som når den aktiveres kan binde målet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Metodikk:
I utgangspunktet settes den aktiverte biosensorbrikken inn i FEB-enheten (figur 1) etterfulgt av utførelsen av trinnene som er beskrevet nedenfor: (1) Kalibrering: Eksperimentet starter med systemkalibrering ved hjelp av 1x fosfatbufret saltvann (PBS; pH = 7,4) for å skape baseline likevektsrespons. (2) Forening: Analytten innføres i brikken, og I-Response overvåkes til bindingsmetningen er nådd. (3) Dissosiasjon: Analytten er dissosiert ved hjelp av 1x PBS. (4) Regenerering: Rester av analytten fjernes ved hjelp av 1x PBS. (5) Vasking: Totalt fem vasker utføres ved hjelp av 1x PBS for grundig fjerning av de bundne og ubundne analyttene fra brikken.

Analyse:
Dataanalyse utføres ved hjelp av den helautomatiske programvaren som følger med instrumentet. Den automatiserte analyseprogramvaren genererer en Hill fit-tomt med en K_D-verdi . Hill fit plott beskriver foreningen av en analytt til målproteinet som en funksjon av analyttkonsentrasjoner. Konsentrasjonen der en halvmaksimal respons oppnås er proporsjonal med K_D-verdien . En lav K_D-verdi representerer høy bindingsaffinitet og omvendt.

For å validere dataene som er hentet fra FEB-eksperimentet, blir I-Responses hentet fra hvert avlesningspunkt for hver analyttkonsentrasjon ved hjelp av datagjennomgangs-/eksportprogramvaren og kan eksporteres til annen statistisk analyseprogramvare (se Tabell over materialer) som forklart nedenfor.

Protocol

MERK: De rekombinante proteinene som ble brukt i denne studien, Hsp90 og Cdc37, ble kommersielt oppnådd (se Materialfortegnelser). 1. Chip aktivering MERK: Alle materialer som skal brukes i eksperimentet er oppført i materialtabellen. Filtrer alle forberedte løsninger gjennom et sterilt 0,2 μm filter. Forbered 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) karbodiimid (EDC) oppløsning ved å tilsette 2 mg EDC til…

Representative Results

Resultater fra eksperiment 1:Målproteinet Hsp90 (500 nM) ble immobilisert til brikken etter mål-immobiliseringsprotokollen som beskrevet ovenfor. For det første eksperimentet ble 10 konsentrasjoner av analyttproteinet, Cdc37, fra 25 nM til 5000 nM, utarbeidet basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen (se tabell 1). Trinnene i eksperimentet kan overvåkes i sanntid ved å følge endringene som skjer i I-Response (figur 3…

Discussion

I denne studien ble muligheten for å bruke FEB-teknologien (en kinetisk karakteriseringstilnærming i sanntid) evaluert for å bestemme den biomolekylære interaksjonen mellom Hsp90 og Cdc37. Det første utforskende eksperimentet (første eksperiment) antydet at valg av riktige analyttkonsentrasjoner er en kritisk del av eksperimentet, og at eksperimentet bør utformes ved å inkludere konsentrasjonspunkter over og under K_D-verdien , som ble spådd basert på dataene som er tilgjengelige i litteraturen.

<…

Materials

Automated analysis software	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to in the text as the automated analysis software supplied with the instrument. Generates automated analysis.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)	Agile plus software, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	biosensor chip
Data review software	Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Referred to as the supplied data review software in the text. Supplied with the instrument and allows to review and export the information data points.
Dialysis bag	CelluSep,  Membrane filtration products	T2-10-15 CAS number: NA	T2 tubings (6,000-8,000 MWCO), (10 mm fw, 6.4mm Ø, 0.32ml/cm, 15m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)	Cardea (Nanomed)	EDC160322-02 CAS number: 25952-53-8	White powder
ITC (Isothermal titration calorimetry) system	Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)	NA CAS number: NA
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid) buffer	Merck	M3671-50G CAS number: 4432-31-9	White powder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips	Cardea (Nanomed)	NA CAS number: NA	Graphene-based chip
PBS (Phosphate-buffered saline) X 10	Bio-Lab	001623237500  CAS number: 7758-11-4	Liquid transparent solution
Pipete	Thermo Scientific	11855231 CAS number: NA	Finnpipette F3 5-50 µL, yellow
Quench 1 (3.9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)	Cardea (Nanomed)	0105-001-002-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8.5))	Cardea (Nanomed)	0105-001-003-001 CAS number: NA	Liquid, transparent solution
Recombinant protein Cdc37	Abcam	ab256157 CAS number: NA
Recombinant protein Hsp90 beta	Abcam	ab80033 CAS number: NA
Spreadsheet	Excel, Microsoft office	NA CAS number: NA
Statistical software	GraphPad, Prism	NA CAS number: NA	Referred to as the other statistical software. Sigma plot, phyton or other statistical programes may also be used
Sulfo-NHS	Cardea (Nanomed)	NHS160321-07 CAS number: 106627-54-7	White powder
Tips	Alex red	LC 1093-800-000 CAS number: NA	Tip 1-200 µl, in bulk, 1,000 pcs