Sanntidsdeteksjon og fangst av invasive celledelpopulasjoner fra samkulturer
Summary
Vi beskriver en tilnærming for å oppdage og fange invasive celle subpopulations i sanntid. Den eksperimentelle designen bruker sanntids cellulær analyse ved å overvåke endringer i den elektriske impedansen av celler. Invasiv kreft, immun- eller endotelceller eller stromale celler i komplekse vev kan fanges opp, og effekten av samkulturer kan vurderes.
Abstract
Invasjon og metastatisk spredning av kreftceller er den viktigste dødsårsaken til kreft. Analyser utviklet seg tidlig for å måle det invasive potensialet til kreftcellepopulasjoner genererer vanligvis en enkelt endepunktmåling som ikke skiller mellom kreftcelle subpopulasjoner med forskjellig invasivt potensial. Også tumormikromiljøet består av forskjellige bosatte stromale og immunceller som endrer og deltar i den invasive oppførselen til kreftceller. Invasjon i vev spiller også en rolle i immuncelle-subpopulasjoner som avverger mikroorganismer eller eliminerer syke celler fra parenchyma og endotelceller under vevsoppussing og angiogenese. Sanntids cellulær analyse (RTCA) som benytter impedansbiosensorer for å overvåke celleinvasjon, var et stort skritt fremover utover endepunktmåling av invasjon: Dette gir kontinuerlige målinger over tid og kan dermed avsløre forskjeller i invasjonshastigheter som går tapt i endepunktanalysen. Ved hjelp av dagens RTCA-teknologi utvidet vi tokammermatriser ved å legge til et ytterligere kammer som kan inneholde stromale og / eller immunceller og gjør det mulig å måle invasjonshastigheten under påvirkning av utskilte faktorer fra kokulturerte stromale eller immunceller over tid. Utover dette tillater den unike designen å løsne kamre når som helst og isolere den mest invasive kreftcellen, eller andre celle subpopulations som er til stede i heterogene blandinger av tumorisolasjoner testet. Disse mest invasive kreftcellene og andre celle subpopulasjoner driver ondartet progresjon til metastatisk sykdom, og deres molekylære egenskaper er viktige for dyptgående mekanistiske studier, utvikling av diagnostiske sonder for deteksjon og vurdering av sårbarheter. Dermed kan inkludering av små- eller store molekylmedisiner brukes til å teste potensialet i terapier som retter seg mot kreft og / eller stromale celleunderbefolkninger med sikte på å hemme (f.eks. kreftceller) eller forbedre (f.eks. immunceller) invasiv oppførsel.
Introduction
Celleinvasjon er en viktig prosess som gjør det mulig for celler å krysse kjellermembranbarrierer som svar på miljøsignaler levert av stromale celler. Det er et avgjørende skritt i flere stadier av utvikling for immunresponser, sårheling, vevsreparasjon og maligniteter som kan utvikle seg fra lokale lesjoner til invasive og metastatiske kreftformer1. Analyser utviklet seg tidlig for å måle det invasive potensialet til cellepopulasjoner genererer vanligvis en enkelt endepunktmåling eller krever forhåndsmerking av invasive celler2. Integreringen av mikroelektronikk og mikrofluidikkteknikker er nå utviklet for å oppdage ulike aspekter ved cellebiologi som levedyktighet, bevegelse og vedlegg ved hjelp av elektrisk impedans av levende celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmåling gir mulighet for en etikettfri, ikke-invasiv og kvantitativ vurdering av cellestatus3. Her beskriver vi en trekammeret matrise basert på utformingen av RTCA-systemet (Real-Time Cellular Analysis) som ble utviklet av Abassi et al.5. Den trekammerede matrisen gjør det mulig å vurdere samkulturerte celler på cellulær invasjon og gjenvinning av invasive celler for ytterligere analyser eller ekspansjon.
I celleanalysatorsystemet invaderer celler gjennom en ekstracellulær matrise belagt på en porøs membran og når en interdigitert elektrodematrise plassert på motsatt side av barrieren. Etter hvert som de invasive cellene fortsetter å feste og okkupere denne elektrodematrisen over tid, endres den elektriske impedansen parallelt. Det nåværende systemet består av en celleinvasjon og migrasjonsplate (CIM) 16-brønnsplate med to kamre. RTCA-DP -instrumentet (dual purpose) (kalt dual purpose cell analyzer heretter) inneholder sensorer for impedansmåling og integrert programvare for å analysere og behandle impedansdataene. Impedansverdier ved baseline avhenger av mediets ioniske styrke i brønnene og endres etter hvert som cellene festes til elektrodene. Impedansendringene avhenger av antall celler, deres morfologi og i hvilken grad celler festes til elektrodene. En måling av brønnene med medier før cellene tilsetts betraktes som bakgrunnssignalet. Bakgrunnen trekkes fra impedansmålinger etter å ha nådd likevekt med celler som fester og sprer seg på elektrodene. En enhetsløs parameter for cellenes status på en elektrode kalt Cell Index (CI) beregnes som følger: CI = (impedans etter likevekt – impedans i fravær av celler) / nominell impedansverdi6. Når overføringshastigheten for ulike cellelinjer sammenlignes, kan Delta CI brukes til å sammenligne cellestatus uavhengig av forskjellen i vedlegg som er representert i de første målingene.
Den nydesignede trekammerde matrisen bygger på den eksisterende designen og bruker toppkammeret fra dobbeltbrukscelleanalysatorsystemet som inneholder elektrodene. De modifiserte midt- og bunnkamrene er tilpasset monteringen i dobbeltbrukscelleanalysatoren for impedansmåling og analyse ved hjelp av den integrerte programvaren. De to viktigste fremskrittene som den nye designen gir over den eksisterende dual-chamber CIM-platen (kalt celleanalysatorplate heretter) er: i) evnen til å gjenopprette, og deretter analysere invasive celle subpopulations som er til stede i heterogene celleblandinger og ii) muligheten til å vurdere virkningen av utskilte faktorer fra kokulturerte stromale eller immunceller på celleinvasjon (figur 1).
Denne teknologien kan være nyttig for å studere subpopulasjonene av celler med forskjellig invasiv kapasitet. Det inkluderer (a) invasive kreftceller som invaderer omkringliggende vev eller blod- og lymfatiske kar eller ekstravasat på metastatiske såddsteder i fjerne organer, (b) celler fra immunsystemet som invaderer vev for å takle patogener eller syke celler, (c) endotelceller som invaderer vev for å danne nye blodkar under vevsreorganisering eller sårheling, så vel som (d) stromale celler fra tumormikromiljøet som støtter og invaderer sammen med kreftceller. Tilnærmingen tillater inkludering av stromal kryssprat som kan modulere cellemotilitet og invasjon. Mulighetsstudiene vist her bruker denne modifiserte matrisen fokusert på kreftcelleinvasjon og samspillet med stroma som modellsystem, inkludert endotelinvasjon som svar på differensialsignaler fra kreftceller. Tilnærmingen kan ekstrapoleres for å isolere kreftceller og andre celletyper som subpopulasjoner av immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testet invasive og ikke-invasive etablerte brystkreftcellelinjer som et prinsippbevis. Vi brukte også celler fra pasient-avledet xenograft (PDX) invasjon som svar på immunceller fra menneskelig benmarg for å vise gjennomførbarhet for fremtidig bruk også i kliniske diagnostiske omgivelser. PDX er pasientsvulstvev som er implantert i immunkompromittert eller humanisert musmodell for å tillate studier av vekst, progresjon og behandlingsalternativer for den opprinnelige pasienten 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har modifisert utformingen av en tokammeret matrise for å inkludere et tredje kammer for overvåking av celleinvasjon i sanntid i nærvær av stromale celler. Vi har observert tydelige effekter av samkulturerte fibroblaster på invasive og ikke-invasive kreftceller som indikerer at matrisen kan brukes til å skille mellom kreftcelle subpopulasjoner som reagerer forskjellig på faktorer produsert av kokulturerte stromalceller. Matrisen ble også brukt til å overvåke endotelcelleinvasjon i stromalt vev, et kritisk sk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, for å gi oss de pasientavledede xenograftene (HCI-010). Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01CA205632, R21CA226542, og delvis av et stipend fra Agilent Technologies.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
