Summary
Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.
Abstract
Invasion und metastasierende Ausbreitung von Krebszellen sind die Haupttodesursache durch Krebs. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Krebszellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung, die nicht zwischen Krebszellsubpopulationen mit unterschiedlichem invasivem Potenzial unterscheidet. Außerdem besteht die Tumormikroumgebung aus verschiedenen residenten Stroma- und Immunzellen, die das invasive Verhalten von Krebszellen verändern und daran teilnehmen. Das Eindringen in Gewebe spielt auch eine Rolle bei Immunzellsubpopulationen, die Mikroorganismen abwehren oder erkrankte Zellen aus dem Parenchym und den Endothelzellen während des Gewebeumbaus und der Angiogenese eliminieren. Die Echtzeit-Zellanalyse (Real-Time Cellular Analysis, RTCA), die Impedanz-Biosensoren zur Überwachung der Zellinvasion verwendet, war ein wichtiger Schritt über die Endpunktmessung der Invasion hinaus: Sie ermöglicht kontinuierliche Messungen im Laufe der Zeit und kann somit Unterschiede in den Invasionsraten aufdecken, die im Endpunktassay verloren gehen. Mit der aktuellen RTCA-Technologie haben wir Zweikammer-Arrays erweitert, indem wir eine weitere Kammer hinzugefügt haben, die Stroma- und / oder Immunzellen enthalten kann und es ermöglicht, die Invasionsrate unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen im Laufe der Zeit zu messen. Darüber hinaus ermöglicht das einzigartige Design jederzeit das Ablösen von Kammern und die Isolierung der invasivsten Krebszelle oder anderer Zellsubpopulationen, die in heterogenen Mischungen von getesteten Tumorisolaten vorhanden sind. Diese invasivsten Krebszellen und andere Zellsubpopulationen treiben das maligne Fortschreiten zu metastasierenden Erkrankungen voran, und ihre molekularen Eigenschaften sind wichtig für eingehende mechanistische Studien, die Entwicklung diagnostischer Sonden für ihre Erkennung und die Bewertung von Schwachstellen. So kann die Einbeziehung von nieder- oder großmolekularen Medikamenten genutzt werden, um das Potenzial von Therapien zu testen, die auf Krebs und/oder Stromazellsubpopulationen abzielen, mit dem Ziel, invasives Verhalten zu hemmen (z. B. Krebszellen) oder zu verstärken (z. B. Immunzellen).
Introduction
Die Zellinvasion ist ein wichtiger Prozess, der es Zellen ermöglicht, Basalmembranbarrieren als Reaktion auf Umwelthinweise von Stromazellen zu überwinden. Es ist ein entscheidender Schritt in mehreren Entwicklungsstadien für Immunantworten, Wundheilung, Gewebereparatur und Malignome, die von lokalen Läsionen zu invasiven und metastasierenden Krebsarten übergehen können1. Assays, die früh entwickelt wurden, um das invasive Potenzial von Zellpopulationen zu messen, erzeugen typischerweise eine Einzelendpunktmessung oder erfordern eine Vormarkierung invasiver Zellen2. Die Integration von Mikroelektronik- und Mikrofluidik-Techniken wird nun entwickelt, um verschiedene Aspekte der Zellbiologie wie Lebensfähigkeit, Bewegung und Befestigung unter Verwendung der elektrischen Impedanz lebender Zellen auf Mikroelektroden 3,4 zu erkennen. Die Impedanzmessung ermöglicht eine markierungsfreie, nicht-invasive und quantitative Beurteilung des Zellstatus3. Hier beschreiben wir ein dreikammeriges Array, das auf dem Design des Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -Systems basiert, das von Abassi et al.5 entwickelt wurde. Das dreikammerige Array ermöglicht die Beurteilung von kokultivierten Zellen auf zelluläre Invasion und die Erholung invasiver Zellen für zusätzliche Analysen oder Expansion.
Im Zellanalysatorsystem dringen Zellen durch eine extrazelluläre Matrix ein, die auf eine poröse Membran aufgetragen ist, und erreichen ein interdigitalisiertes Elektrodenarray, das auf der gegenüberliegenden Seite der Barriere positioniert ist. Da die invasiven Zellen dieses Elektrodenarray im Laufe der Zeit weiter anheften und besetzen, ändert sich die elektrische Impedanz parallel. Das aktuelle System besteht aus einer CIM-Platte (Cell Invasion and Migration) mit zwei Kammern. Das RTCA-DP (Dual Purpose) (fortan Dual Purpose Cell Analyzer genannt) Gerät enthält Sensoren zur Impedanzmessung und integrierte Software zur Analyse und Verarbeitung der Impedanzdaten. Die Impedanzwerte zu Studienbeginn hängen von der Ionenstärke der Medien in den Vertiefungen ab und werden geändert, wenn sich die Zellen an die Elektroden anlagern. Die Impedanzänderungen hängen von der Anzahl der Zellen, ihrer Morphologie und dem Ausmaß ab, in dem sich die Zellen an die Elektroden anheften. Eine Messung der Vertiefungen mit Medien vor der Zugabe der Zellen wird als Hintergrundsignal betrachtet. Der Hintergrund wird von den Impedanzmessungen abgezogen, nachdem das Gleichgewicht erreicht wurde, wobei sich die Zellen an die Elektroden anheften und sich auf sie ausbreiten. Ein einheitsloser Parameter des Status der Zellen auf einer Elektrode namens Cell Index (CI) wird wie folgt berechnet: CI = (Impedanz nach Gleichgewicht - Impedanz in Abwesenheit von Zellen) / Nennimpedanzwert6. Wenn Migrationsraten verschiedener Zelllinien verglichen werden, kann der Delta CI verwendet werden, um den Zellstatus unabhängig von dem Unterschied in der Befestigung zu vergleichen, der in den ersten Messungen dargestellt wird.
Das neu entwickelte dreikammerige Array baut auf dem bestehenden Design auf und verwendet die obere Kammer des Zweizweck-Zellanalysatorsystems, das die Elektroden enthält. Die modifizierten mittleren und unteren Kammern sind so angepasst, dass sie mit der integrierten Software in den Zweizweck-Zellanalysator zur Impedanzmessung und -analyse passen. Die beiden wichtigsten Fortschritte, die das neue Design gegenüber der bestehenden Zweikammer-CIM-Platte (von nun an Zellanalysatorplatte genannt) bietet, sind: i) die Fähigkeit, sich zu erholen und dann invasive Zellsubpopulationen zu analysieren, die in heterogenen Zellmischungen vorhanden sind, und ii) die Option, den Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen auf die Zellinvasion zu bewerten (Abbildung 1).
Diese Technologie kann bei der Untersuchung der Subpopulationen von Zellen mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten nützlich sein. Dazu gehören (a) invasive Krebszellen, die in umliegende Gewebe oder Blut- und Lymphgefäße eindringen oder an metastasierten Aussaatstellen in entfernten Organen extravasieren, (b) Zellen des Immunsystems, die in Gewebe eindringen, um Krankheitserreger oder erkrankte Zellen zu bekämpfen, (c) Endothelzellen, die während der Gewebereorganisation oder Wundheilung in Gewebe eindringen, um neue Blutgefäße zu bilden, sowie (d) Stromazellen aus der Tumormikroumgebung, die zusammen mit Krebszellen unterstützen und eindringen. Der Ansatz ermöglicht die Einbeziehung von stromalem Cross-Talk, das die Zellmotilität und -invasion modulieren kann. Die hier gezeigten Machbarkeitsstudien verwenden dieses modifizierte Array, das sich auf die Invasion von Krebszellen und die Interaktion mit dem Stroma als Modellsystem konzentriert, einschließlich der endothelialen Invasion als Reaktion auf differentielle Signale von Krebszellen. Der Ansatz kann extrapoliert werden, um Krebszellen und andere Zelltypen wie Subpopulationen von Immunzellen, Fibroblasten oder Endothelzellen zu isolieren. Wir haben invasive und nicht-invasive etablierte Brustkrebszelllinien als Proof of Principle getestet. Wir verwendeten auch Zellen aus der Invasion von Patienten-abgeleiteten Xenotransplantaten (PDX) als Reaktion auf Immunzellen aus menschlichem Knochenmark, um die Machbarkeit für den zukünftigen Einsatz auch in klinischen Diagnoseumgebungen zu zeigen. PDX sind Patiententumorgewebe, die in ein immungeschwächtes oder humanisiertes Mäusemodell implantiert werden, um die Untersuchung von Wachstum, Progression und Behandlungsmöglichkeiten für den ursprünglichen Patientenzu ermöglichen 7,8.
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Protocol
Die Studie wurde vom Institutional Review Board der Georgetown University (IRB # 2002-022) überprüft und als "befreit" betrachtet. Frisch geerntetes Knochenmarkgewebe wurde aus entsorgten gesunden menschlichen Knochenmarksammelfiltern entnommen, die de-identifiziert worden waren.
1. Neues Kammerdesign (Abbildung 2)
- Öffnen Sie eine neue Zweikammer-Zellanalysatorplatte. Stellen Sie die obere Kammer mit Elektroden beiseite.
- Rasieren Sie mit einer Fräsmaschine 2 mm der U-förmigen Bodenvertiefungen der Zellanalysatorplatte ab.
- Befestigen Sie eine 2 cm x 7 cm große Polyethersulfonmembran (PES) mit einer Porengröße von 0,2 μm mit UV-kuratiertem Klebstoff am Boden der rasierten Vertiefungen. Planen Sie 30 Minuten Aushärtungszeit ein, um sicherzustellen, dass der Kleber vollständig ausgehärtet und inert ist.
- Schneiden Sie mit einer Fräsmaschine zwei Längsschlitze (1,5 mm x 5,6 mm) an den Seiten aus, um in die Grate der neu hergestellten dritten Kammer einzurasten.
- Erstellen Sie mit einer Fräsmaschine eine dritte Polycarbonatkammer, die die Gesamtabmessungen der Zellanalysatorplatte nachbildet. 72 mm x 18 mm (Materialverzeichnis).
- Erstellen Sie Vertiefungen mit einer Tiefe von 4,8 mm und einem Durchmesser von 4,75 mm, um das 16-Well-Design der Zellanalysatorplatte zu replizieren. Dies ermöglicht 90 μL Volumen pro Well.
- An den Seiten erzeugen Sie zwei dreieckige Grate, so dass die Kammer in die ursprünglichen Schlitze einrastet, die in Schritt 1.4 erstellt wurden. Der horizontale Teil des Dreiecks beträgt 1,5 mm, der vertikale 1,4 mm und die Hypotenuse 2,052 mm.
- Erstellen Sie auf der kurzen Seite einen Knopf mit einem Durchmesser von 50,8 mm und einer Höhe von 1,397 mm, der in die Kerbe der Originalplatte passt (Abbildung 2, Mitte).
- Verwenden Sie eine 0,9 mm dicke Gummischeibe für jedes Bohrloch, um eine versiegelte Passform zu gewährleisten.
2. Zellkultur (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-Fibroblasten)
- Waschen Sie adhärente Zellkulturen (~ 70% Konfluenz) mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzuheben.
- Neutralisieren Sie die Trypsinlösung mit serumhaltigen Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen mit einem Aliquot der Zellsuspension.
HINWEIS: Die spezifischen Zellkulturmedien finden Sie in Tabelle 1.
3. Patientenabgeleitete Xenotransplantat-Dissoziation
- Ein frisches Tumorstück (1 cm2) mit einem sterilen Skalpell in feinen Brei schneiden.
- In ein 50 ml konisches Rohr mit 20 ml DMEM F12-Medien geben, ergänzt mit 3 mg/ml Trypsin und 2 mg/ml Kollagenase.
- Inkubieren Sie in einem Thermoshaker (150 U / min) bei 37 ° C für 20 min.
- Drehen Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min; Entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 20 μL DMEM F12 + 2% FBS hinzu, um die Zellen zu waschen; Drehen Sie 5 Minuten lang mit 300 x g und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen noch zwei weitere Male.
- Resuspendieren Sie in 1 ml PDX-Medien (Tabelle 1), um die Zellen zu zählen.
4. Knochenmarkzellextraktion
- Spülen Sie den Auffangfilter für Knochenmark (BM) mit 25 ml 1x PBS.
HINWEIS: In dieser Studie wurde PBS zu einem gebrauchten BM-Sammelfilter aus dem Krankenhaus hinzugefügt, um den verbleibenden BM im Filter zu sammeln. - Fügen Sie das gespülte BM langsam zu einem konischen 50-ml-Rohr mit 25 ml Dichtegradientenmedium hinzu, wobei Sie darauf achten, die Schichten so getrennt wie möglich zu halten.
- Drehen bei 800 x g für 20 min bei 18 °C
- Siphonieren Sie die oberen Schichten nach der Zentrifugation ab (Fett / Plasma) und übertragen Sie 5 ml der weißen Schicht über dem Dichtegradientenmedium, das die BM-Zellen enthält, auf ein konisches 15-ml-Rohr.
HINWEIS: Alternativ tauchen Sie eine 5-ml-Pipette in die oberste Schicht, bis sie die mittlere Schicht (BM) berührt, und pipettieren Sie die mittlere Schicht sehr langsam, ohne die Pipette zu bewegen. - Füllen Sie das 15 ml konische Rohr mit 1x PBS (~10 mL) und drehen Sie es bei 300 x g für 15 min.
- Entfernen Sie den Überstand; das verbleibende weiße Pellet ist das BM.
- Wenn rote Blutkörperchen im Pellet beobachtet werden, fügen Sie 5 ml RBC-Lyselösung hinzu (Tabelle der Materialien) und lassen Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) einwirken. Drehen Sie 5 Minuten lang mit 300 x g und entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 10 ml 1x PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, drehen Sie 5 Minuten lang mit 300 x g und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die RBC-Lyse (Schritt 4.7), bis das Pellet weiß ist.
5. Zellaussaat und -montage
- Legen Sie alle drei sterilen Kammern in die Gewebekulturhaube.
- Suchen Sie den Knopf an der kurzen Seite der unteren Kammer. Richten Sie die untere Kammer so aus, dass der Knopf dem Experimentator zugewandt ist.
- Fügen Sie 30.000-50.000 Zellen in 90 μL Medien zu jeder Vertiefung der unteren Kammer hinzu. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Dies sind die Stromazellen, die sezernierte Faktoren liefern, aber von den Elektroden der oberen Kammer nicht erkannt werden.
- Verwenden Sie 5% fetale Rinderserum-ergänzte Medien in zwei unteren Kammervertiefungen als Positivkontrolle für die Zellmotilität. Verwenden Sie 0% serum-ergänzte Medien als Negativkontrolle.
- Lassen Sie die untere Kammer mit den Zellen 10-15 Minuten in der Haube sitzen, um sich niederzulassen.
HINWEIS: Dieser Schritt wird empfohlen, wenn Zellen adhärent sind oder in Suspension wachsen. - Drehen Sie die untere Kammer um 90° und platzieren Sie die mittlere Kammer oben, so dass der Knopf an der unteren Kammer in die Kerbe der mittleren Kammer gleitet.
HINWEIS: Der Knopf an der unteren Kammer und der blaue Punkt an der mittleren Kammer befinden sich an gegenüberliegenden Enden der Baugruppe. - Drücken Sie vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Geben Sie 160 μL serumfreies Medium in alle Vertiefungen der mittleren Kammer.
- Stellen Sie sicher, dass ein kuppelförmiger Meniskus sichtbar ist, nachdem die Vertiefungen gefüllt wurden. Andernfalls passen Sie das endgültige Volumen basierend auf der Pipettenkalibrierung an. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Platzieren Sie die obere Kammer mit Elektroden nach unten auf der mittleren Kammer und stellen Sie sicher, dass die blauen Punkte auf der mittleren und oberen Kammer ausgerichtet sind.
- Drücken Sie vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Geben Sie 25-50 μL serumfreies Medium in die obere Kammer.
- Montieren Sie die Baugruppe auf dem Zweizweck-Zellanalysator im Gewebekultur-Inkubator und warten Sie 30 Minuten, bevor Sie den Hintergrund messen.
HINWEIS: Diese Zeit ist notwendig, um das Array auszugleichen und kann verwendet werden, um die Zelllinien vorzubereiten, die der oberen Kammer hinzugefügt werden sollen. - Messen Sie den Hintergrund (siehe Abschnitt 6) und legen Sie die Baugruppe wieder in die Gewebekulturhaube.
- Fügen Sie 30.000-50.000 Zellen in 100 μL serumfreiem Medium zu jeder Vertiefung der oberen Kammer hinzu. Dies sind die Zellen, die die Elektrode erkennt, sobald sie erfolgreich durch die Membran wandern.
HINWEIS: Um eine maximale Reaktion zu erreichen, wird empfohlen, Zellen in serumfreien oder serumarmen Medien für 6-18 h zu züchten, bevor der Assay durchgeführt wird. - Lassen Sie die Baugruppe 30 Minuten in der Haube stehen, bevor Sie sie zur Impedanzmessung auf dem Zweizweck-Zellanalysator montieren.
6. Hintergrund- und Impedanzmessung
- Setzen Sie das Array in die Halterung des Dual-Purpose-Zellanalysators ein.
- Öffnen Sie die Zellanalysator-Software und wählen Sie die zu verwendende Dockingstation aus.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Nachricht und stellen Sie sicher, dass Verbindungen OK angezeigt werden, um sicherzustellen, dass das Array gut in der Dockingstation platziert ist und die Elektroden gut auf die Sensoren ausgerichtet sind.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Testnotizen und geben Sie so viele Informationen wie möglich zum Experiment ein.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Layout und geben Sie die Beschreibung des Array-Layouts ein.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitplan und fügen Sie zwei Schritte aus dem Menü Schritte hinzu. Ein Hintergrundschritt (ein Sweep) und ein Testschritt mit 100 Sweeps - ein Sweep alle 15 Minuten, insgesamt 25 h.
- Nachdem sich das Array 30 Minuten lang im Inkubator des Zweizweck-Zellanalysators befunden hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe , um die Hintergrundmessung zu starten. Ein Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, den Ordner zum Speichern der Daten auszuwählen, wird angezeigt.
- Nachdem die Hintergrundmessung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Array aus der Halterung und legen Sie es wieder in die Zellkulturhaube.
- Geben Sie Zellen in die obere Kammer, wie in Schritt 5.13 beschrieben, und bewahren Sie die Baugruppe 30 Minuten lang in der Gewebekulturhaube auf, damit sich die Zellen absetzen können.
- Setzen Sie das Array wieder in den Dual-Purpose-Zellanalysator ein, und überprüfen Sie die Registerkarte Meldung auf die Meldung Verbindungen OK.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe , um die Impedanzmessung zu starten.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Plot , um den Fortschritt des Signals zu überwachen.
- Wenn der Endpunkt vor 25 Stunden erreicht wird, klicken Sie im Dropdown-Menü Ausführen auf den Schritt Abbrechen.
- Um Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, wählen Sie Im Listenformat kopieren aus, und fügen Sie die Daten dann in eine Tabelle ein.
HINWEIS: Die Daten können als Zellindex oder Deltazellindex exportiert werden. Für den Export können auch Diagramm- und/oder Layoutinformationen ausgewählt werden.
7. Ablösung und Zellabholung
- Überwachen Sie die Migrationsrate in Echtzeit auf dem Zweizweck-Zellanalysator, um den interessierenden Haltepunkt (6-18 h) zu bestimmen.
HINWEIS: Der Haltepunkt hängt von der Invasionsrate der Zelle ab und davon, wann ein deutliches Invasionssignal von der Negativkontrolle erreicht wird. - Sobald dies erreicht ist, demontieren Sie die Baugruppe aus dem Zweizweck-Zellanalysator und legen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
- Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, um die Zellen aus den interessierenden Vertiefungen zu sammeln.
- Legen Sie die Baugruppe in eine 10 cm große Schale, um Flüssigkeiten aufzunehmen, wenn sich die Kammern lösen.
- Drücken Sie die flexiblen Schnappenden an der Längsseite der mittleren Kammer nach innen, bis ein Klickgeräusch zu hören ist.
- Demontieren Sie die obere Kammer und kehren Sie sie in eine neue 10-cm-Schale um.
- Verwenden Sie einen Zellheber mit einer 13-mm-Klinge, um die Zellen aus allen Vertiefungen zu sammeln, die den gleichen experimentellen Zustand aufweisen (z. B. Zelltyp, medikamentöse Behandlung usw.).
HINWEIS: Entwerfen Sie den Aufbau so, dass er mindestens zwei Vertiefungen für jede experimentelle Bedingung aufweist, um eine statistisch signifikante Änderung der Negativkontrollen zu erreichen. - Spülen oder tauchen Sie die Klinge in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln.
- Drehen Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min herunter.
- Vermehren Sie die gesammelten Zellen (siehe Abschnitt 8) oder führen Sie Endpunktanalysen wie Einzelzell-RNA-Seq durch.
HINWEIS: Verwenden Sie für Bulk-RNA-Seq ein RNA-Extraktionskit mit niedriger Zellzahl.
8.3D Zellausbreitung und -abruf
HINWEIS: Aufgrund der geringen Anzahl der gesammelten Zellen können Sie die Zellen in 3D mit einer extrazellulären Matrix (ECM) säen, um die Lebensfähigkeit zu verbessern. Allerdings ist die 2D-Kultur an dieser Stelle auch eine Option, insbesondere wenn die verwendeten Zellen aus etablierten Zelllinien stammen.
- Tauen Sie ein Aliquot der Basalmembranmatrix bei 4 °C über Nacht auf. Halten Sie die Basalmembranmatrix auf Eis, bis sie einsatzbereit ist.
- Geben Sie 25 μL kalte Basalmembranmatrix in das Pellet der gesammelten lebenden Zellen und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um zu mischen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Fügen Sie die Zell-Basal-Membran-Matrixmischung auf den Boden einer kleinen Gewebekulturvertiefung (dh in einer 96-Well-Platte) hinzu und bilden Sie eine Kuppel. Versuchen Sie, die Wände des Brunnens nicht zu berühren. Bei 37 °C für 20 min inkubieren, bevor Sie vorsichtig 100 μL Medien tropfenweise hinzufügen.
- Um Zellen zu gewinnen, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 100 μL Dispase zu jedem Well hinzu.
- Inkubieren Sie bei RT für 10 Minuten und pipettieren Sie gelegentlich auf und ab.
- Die Zellen und die gelöste Basalmembranmatrix werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie 1 ml 1x PBS hinzu, drehen Sie bei 300 x g für 5 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche einmal.
- Aspirieren Sie den Überstand. Teilen Sie die Zellen im Pellet auf oder führen Sie eine Endpunktanalyse durch.
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Representative Results
Unter Verwendung des neu entwickelten Dreikammer-Arrays wurde die Invasion der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stromazellen wie Fibroblasten getestet. Die MDA-MB-231-Zellinvasion wurde verstärkt, als bestrahlte Schweizer 3T3-Fibroblasten (J2-Stamm) in der Bodenkammer ausgesät wurden, was den Austausch von Faktoren zwischen den beiden Zelllinien ermöglichte. Interessanterweise nahm die MDA-MB-231-Invasion zu, wenn die Anzahl der 3T3-J2-Zellen verdoppelt wurde (Abbildung 3A). Auf der anderen Seite scheint die Invasionsrate eines invasiven Klons von MCFDCIS-Zellen (DCIS-Δ4)9 durch das Übersprechen mit 3T3-J2-Zellen gehemmt zu werden (Abbildung 3B). Diese Daten zeigen die nützliche Anwendung des dreikammerigen Arrays, um unterschiedliche Auswirkungen des Stroma, in diesem Fall Fibroblasten, auf die Zellinvasion zu messen.
Um die Veränderung der Motilität und Invasion von Endothelzellen als Reaktion auf Signale von entweder invasiven (MDA-MB-231) 10,11- oder nicht-invasiven (DCIS) 12-Krebszellen zu überwachen, wurden menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) verwendet, die Endothelzellen darstellen, die die Wände der Blutgefäße auskleiden. HUVECs waren invasiver als Reaktion auf Faktoren, die von MDA-MB-231-Zellen sezerniert wurden, im Gegensatz zu denen, die von DCIS-Zellen sezerniert wurden (Abbildung 4). Dies steht im Einklang mit der Fähigkeit invasiver Tumore, Endothelzellen für die Blutgefäßbildung und spätere Verbreitung in den Kreislauf zu rekrutieren.
Die obigen Daten zeigen die Fähigkeit des Zellanalysatorsystems, verschiedene Invasionsraten von Zelllinien zu überwachen. Wenn die Invasion beginnt, schreitet sie voran und erreicht ein Plateau. Dies ermöglicht es dem Benutzer, den Zeitpunkt des Interesses zu wählen, zum Beispiel nach den ersten 2-3 Stunden der Invasion, um die Pionierzellen zu erfassen, die die Invasion initiieren und sich von den folgenden Zellen unterscheiden, die danach durch kollektive Invasion eindringen.
Während die oben genannten Daten einen soliden Beweis für das Prinzip für die Verwendung des dreikammerigen Arrays zur Beobachtung der Invasion in einer Co-Kultur-Umgebung zeigen, wollten wir die potenzielle Verwendbarkeit dieses Arrays in klinischen und diagnostischen Umgebungen testen. Dazu wurde die Invasion von Zellsuspensionen aus patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX)8 überwacht, die mit Immunzellen aus menschlichen Knochenmarkproben kokultiviert wurden. Insgesamt wurden menschliche Knochenmark-Immunzellen (BM) mit oder ohne Serum auf die untere Kammer gesät. Die Invasion von PDX-Zellen aus der obersten Kammer nahm als Reaktion auf kokultivierte BM-Immunzellen zu (Abbildung 5). Interessanterweise war das Vorhandensein von 2% Serum in der unteren Kammer mit den BM-Zellen für die PDX-Invasion unerlässlich.
Abbildung 1: Workflow des Zellinvasionsüberwachungs- und Zellsammelsystems . (A) Stromazellen werden der unteren Kammer hinzugefügt, die auf einer mittleren Kammer montiert ist, die als Zellbarriere dient, die nur für lösliche Faktoren durchlässig ist. (B) Die obere Kammer mit Impedanz-Biosensoren empfängt die zu überwachende Zelllinie. Die Echtzeit-Invasion wird aufgezeichnet, bis ein benutzerdefinierter Zeitpunkt für die Zellsammlung erreicht ist. (C) Die demontierte obere Kammer wird invertiert, und die Zellen werden mit einem Zellheber geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bilder der Array-Kammern und Modifikationen . (A) Die drei Kammern, die zum Aufbau des Arrays verwendet wurden. An der oberen Kammer, in der die Elektroden untergebracht sind, wurden keine Änderungen vorgenommen. (B) Von den mittleren Kammerschächten wurde eine Höhe von 2 mm abrasiert und eine Membran am offenen Boden befestigt; Auf jeder Seite wurden Längsschlitze (1,5 mm x 5,6 mm) hinzugefügt. (C) Untere Kammer (72 mm x 18 mm), die hergestellt wurde, um das 16-Well-Design zu replizieren; Die Vertiefungen sind 4,8 mm tief und haben einen Durchmesser von 4,75 mm, Dreieckskämme (1,5 mm horizontal x 1,4 mm vertikal) werden an den Seiten hinzugefügt, um in die mittleren Kammerschlitze zu klicken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Wirkung von kokultivierten Fibroblasten auf die Invasion von Krebszellen. (A) Echtzeit-Zellanalyse der MDA-MB-231-Zellinvasion, allein oder in Kokultur mit 3T3-J2-Fibroblasten (untere Kammer). 3T3-J2-Fibroblasten wurden entweder mit 30.000 oder 60.000 Zellen pro Bohrloch ausgesät. (B) Echtzeit-Zellanalyse der DCIS-Δ4-Zellinvasion, allein oder in Kokultur mit 3T3-J2-Fibroblasten (Bodenkammer). Die durchgezogenen Kreise stellen den Mittelwert dar; Die dünnen gepunkteten Linien stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Wirkung von Krebszellen auf die Invasion von Endothelzellen. Echtzeit-Zellanalyse der HUVEC-Invasion allein in Kokultur mit den invasiven MDA-MB-231-Zellen (untere Kammer) oder den nicht-invasiven DCIS-Zellen (untere Kammer). Die durchgezogenen Kreise stellen den Mittelwert dar; Die dünnen gepunkteten Linien stellen die Standardabweichung dar. Delta-Zellindex normalisiert auf die Impedanz zum Zeitpunkt = 1 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zellinvasion von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDX), die mit Immunzellen des Knochenmarks kokultiviert wurden. Einzelne Zellen, die aus PDX (obere Kammer) zerfielen, wurden mit menschlichen Knochenmarkzellen (untere Kammer) kokultiviert, und ihre Invasion wurde im Laufe der Zeit in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum überwacht. Die durchgezogenen Kreise stellen den Mittelwert dar; Die dünnen gepunkteten Linien stellen die Standardabweichung dar. Delta-Zellindex normalisiert auf die Impedanz zum Zeitpunkt = 1 h und 36 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Medien | Bestandteile | Konzentration/Anteil |
| MDA-MD-231 Medien | DMEM | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 10% | |
| J2 Fibroblasten Medien | DMEM | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 10% | |
| DCIS-Medien | DMEM F12 | |
| Pferdeserum (HS) | 5% | |
| Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) | 20 ng/ml | |
| Insulin | 10 μg/ml | |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | |
| Cholera-Toxin | 100 ng/ml | |
| PDX-Medien | DMEM F12 | |
| Fetales Rinderserum (FBS) | 2% | |
| HEPES | 1 Mio. | |
| Insulintransferrin-Selenethanolamin (ITS) | 10 μg/ml | |
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | 1 mg/ml |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien In der Tabelle sind die Zusammensetzungen von MDA-MD-231-Medien, J2-Fibroblastenmedien, DCIS-Medien und PDX-Medien aufgeführt.
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Discussion
Wir haben das Design eines Zweikammer-Arrays modifiziert, um eine dritte Kammer zur Überwachung der Zellinvasion in Echtzeit in Gegenwart von Stromazellen aufzunehmen. Wir haben deutliche Auswirkungen von kokultivierten Fibroblasten auf invasive und nicht-invasive Krebszellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Array verwendet werden kann, um zwischen Krebszellsubpopulationen zu unterscheiden, die unterschiedlich auf Faktoren reagieren, die von kokultivierten Stromazellen produziert werden. Das Array wurde auch verwendet, um die Invasion von Endothelzellen in Stromagewebe zu überwachen, ein kritischer Schritt, während Blutgefäße in Gegenwart von Krebszellen mit unterschiedlichem invasivem Potenzial zu einem angiogenen Reiz sprießen. Diese Experimente zeigen den vielseitigen Einsatz des Arrays für die Isolierung von Krebszellen oder anderen Zellen.
Es wird empfohlen, die Anzahl der Zellen zu optimieren, die jeder Kammer hinzugefügt werden sollen. Aus unserer Erfahrung und der Empfehlung des Herstellers sind 30.000-50.000 Zellen optimal. Da in diesem Array zwei Zelltypen kokultiviert werden können, von denen einer eine Primärkultur von Stromazellen sein kann, wird empfohlen, die Auswirkungen verschiedener Medien auf Zellen zu überwachen, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit verwendet werden. Wir fanden heraus, dass der Hunger der zu überwachenden Zellen die Variation zwischen den Replikaten reduziert. Wenn serumfreie Wachstumsbedingungen für die Zellen schädlich sind, können niedriges Serum und kürzere Hungerzeiten verwendet werden. Die Zugabe einer niedrigen Serummenge (1%-2%) kann für das Überleben von Stromazellen (Primärzellen) in der unteren Kammer entscheidend sein, aber stellen Sie sicher, dass die richtigen Kontrollbedingungen für die Dateninterpretation enthalten sind (d. H. 2% Serum mit und ohne Stromazellen). Wenn die Invasionsraten niedrig sind, können mehr Bohrlöcher pro experimenteller Bedingung die Anzahl der lebensfähigen Zellen erhöhen, die für nachgeschaltete Analysen gesammelt wurden. Bei der Analyse von Patientenbiopsien ist der Zerfall von Gewebe in einzelne Zellen vor dem Testen auf der Zellanalysatorplatte entscheidend. Die Optimierung der Zerfallsbedingungen zur Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist ein wichtiger Schritt vor der Durchführung der Invasionsanalyse. Es ist auch möglich, zusätzliche Aspekte der Invasion zu untersuchen, wie z.B. die Empfindlichkeit gegenüber medikamentöser Behandlung oder die Wirkung von Komponenten der extrazellulären Basalmatrix (ECM) auf die Invasionsrate. ECM ist ein wesentlicher Bestandteil der Mikroumgebung und es wurde berichtet, dass es während der Zellinvasion eine wichtige Rolle spielt13. Mehrere veröffentlichte Studien haben ECM verwendet, um die obere Kammer zu beschichten, bevor invasive Zellen hinzugefügt werden, um ihre Interaktion mit verschiedenen ECM-Komponenten zu überwachen14,15. Das dreikammerige Array ist ein nützliches Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen invasiven und Stromazellen in der Kokultur zu untersuchen. Während das vorgeschlagene Design eine Zellsammlung garantiert, die für die invasiven Zellen ohne Stromazellen spezifisch ist, ist dieser Aufbau möglicherweise nicht optimal, wenn das Übersprechen zwischen den Zellen die physische Interaktion der verschiedenen Zelltypen erfordert. Darüber hinaus können nicht-adhärente Zellen, die in Suspension wachsen, in den hier vorgeschlagenen Methoden nicht gesammelt werden (Verschrottung), jedoch ein anderer Ansatz, bei dem Medien in den zerlegten Kammern, die die nicht-adhärenten Zellen enthalten, gesammelt werden können, um die nicht adhärenten Zellen zu ernten.
Während dieses Array für mehrere Forschungsbereiche verwendet werden kann, die die Zellinvasion in Gegenwart einer stromalen Komponente überwachen, konzentrierten wir uns hier auf die Invasion von Krebszellen und wie dieser Ansatz bösartige Krebszellsubpopulationen in heterogenen biologischen Proben aufdecken kann. Die neue Kapazität des hier verwendeten Dreikammer-Arrays bietet einen funktionellen Assay, um invasive Subpopulationen aus heterogenen Krebszellmischungen zu isolieren, die mehr und weniger invasive Krebszellen enthalten. Die Analyse invasiver und ergebnisrelevanter Krebszellsubpopulationen ist für geeignete mechanistische Studien und molekulare Erkenntnisse, die durch die Analyse einer Mischzellpopulation nicht gewonnen oder verzerrt werden können, unerlässlich. Die Co-Kulturkammer für Stromazellen liefert Einblicke in das Zell-Zell-Cross-Talk in der Tumormikroumgebung während des Fortschreitens zur invasiven Erkrankung.
Als Schritt zur Anwendung auf Gewebeproben, z.B. Tumorbiopsien von Patienten, haben wir Krebszellen verwendet, die aus patientenabgeleiteten Tumorxenotransplantaten (PDXs) isoliert wurden, und den Einfluss menschlicher Knochenmarkzellen auf die Invasion von Tumorzellen getestet. Wir konnten die in den PDXs vorhandenen invasiven Zellen für die nachgelagerte Analyse, d.h. RNA-seq, sammeln. Die Untersuchung von PDXs ist der erste Schritt zur Analyse von Zellsubpopulationen, die in der heterogenen Mischung von Krebszellen in Tumorbiopsien von Patienten vorhanden sind. Das ultimative Ziel wird es sein, solche Tumorbiopsien zu verwenden und Subpopulationen von Krebszellen zu isolieren, die aufgrund ihres Potenzials für eine metastasierende Ausbreitung in sie eindringen und somit zu schlechten Ergebnissen führen. Die Identifizierung der molekularen Merkmale und die Prüfung der Empfindlichkeit dieser invasiven Subpopulationen gegenüber der medikamentösen Behandlung sind zukünftige Anwendungen.
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Disclosures
Die Georgetown University hat ein Patent im Zusammenhang mit einigen der in diesem Manuskript beschriebenen Ansätze eingereicht. G.M.S, A.W, L.D. und M.P werden in diesem Antrag als Erfinder genannt und erklären dies als potenziellen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, für die Bereitstellung der patientenabgeleiteten Xenotransplantate (HCI-010). Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R01CA205632, R21CA226542 und teilweise durch einen Zuschuss von Agilent Technologies unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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