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Cancer Research

वास्तविक समय का पता लगाने और सह संस्कृतियों से इनवेसिव सेल Subpopulations के कैप्चर

Published: March 30, 2022 doi: 10.3791/63512
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University Medical Center, 2Department of Physics, Georgetown University

Summary

हम वास्तविक समय में आक्रामक सेल उप-आबादी का पता लगाने और कैप्चर करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन कोशिकाओं के विद्युत प्रतिबाधा में परिवर्तन की निगरानी करके वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण का उपयोग करता है। जटिल ऊतकों में आक्रामक कैंसर, प्रतिरक्षा, एंडोथेलियल या स्ट्रोमल कोशिकाओं पर कब्जा किया जा सकता है, और सह-संस्कृतियों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है।

Abstract

कैंसर कोशिकाओं का आक्रमण और मेटास्टैटिक प्रसार कैंसर से मृत्यु का प्रमुख कारण है। कैंसर सेल आबादी की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए जल्दी विकसित Assays आमतौर पर एक एकल समापन बिंदु माप उत्पन्न करते हैं जो विभिन्न आक्रामक क्षमता के साथ कैंसर सेल उप-आबादी के बीच अंतर नहीं करता है। इसके अलावा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न निवासी स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाएं होती हैं जो कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार को बदलते हैं और भाग लेते हैं। ऊतकों में आक्रमण भी प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी में एक भूमिका निभाता है जो सूक्ष्मजीवों को बंद कर देता है या ऊतक रीमॉडलिंग और एंजियोजेनेसिस के दौरान पैरेन्काइमा और एंडोथेलियल कोशिकाओं से रोगग्रस्त कोशिकाओं को समाप्त करता है। रियल-टाइम सेलुलर विश्लेषण (RTCA) जो सेल आक्रमण की निगरानी करने के लिए प्रतिबाधा बायोसेंसर का उपयोग करता है, आक्रमण के समापन बिंदु माप से परे एक प्रमुख कदम था: यह समय के साथ निरंतर माप प्रदान करता है और इस प्रकार आक्रमण दरों में अंतर प्रकट कर सकता है जो समापन बिंदु परख में खो गए हैं। वर्तमान आरटीसीए तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने एक और कक्ष जोड़कर दोहरे-कक्ष सरणियों का विस्तार किया जिसमें स्ट्रोमल और / या प्रतिरक्षा कोशिकाएं हो सकती हैं और समय के साथ सह-सुसंस्कृत स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्रावित कारकों के प्रभाव में आक्रमण की दर को मापने की अनुमति देता है। इसके अलावा, अद्वितीय डिजाइन किसी भी समय कक्षों को अलग करने और सबसे आक्रामक कैंसर सेल, या अन्य सेल उप-आबादी को अलग करने की अनुमति देता है जो परीक्षण किए गए ट्यूमर आइसोलेट्स के विषम मिश्रणों में मौजूद हैं। ये सबसे आक्रामक कैंसर कोशिकाएं और अन्य सेल उप-आबादी मेटास्टैटिक रोग के लिए घातक प्रगति को प्रेरित करती हैं, और उनकी आणविक विशेषताएं गहराई से यांत्रिक अध्ययन, उनका पता लगाने के लिए नैदानिक जांच के विकास और कमजोरियों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, छोटे या बड़े अणु दवाओं को शामिल करने का उपयोग उपचारों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है जो कैंसर और / या स्ट्रोमल सेल उप-आबादी को बाधित करने (जैसे, कैंसर कोशिकाओं) या बढ़ाने (जैसे, प्रतिरक्षा कोशिकाओं) आक्रामक व्यवहार के लक्ष्य के साथ लक्षित करते हैं।

Introduction

सेल आक्रमण एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो कोशिकाओं को स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए गए पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में तहखाने झिल्ली बाधाओं को पार करने की अनुमति देती है। यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, घाव भरने, ऊतक की मरम्मत, और दुर्दमताओं के लिए विकास के कई चरणों के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है जो स्थानीय घावों से आक्रामक और मेटास्टैटिक कैंसरतक प्रगति कर सकते हैं। सेल आबादी की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए जल्दी विकसित Assays आमतौर पर एक एकल समापन बिंदु माप उत्पन्न करते हैं या आक्रामक कोशिकाओं के पूर्व-लेबलिंग की आवश्यकता होतीहै 2। माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स तकनीकों का एकीकरण अब सेल जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है जैसे कि व्यवहार्यता, आंदोलन, और लगाव माइक्रोइलेक्ट्रोड्स 3,4 पर जीवित कोशिकाओं की विद्युत प्रतिबाधा का उपयोग करके। प्रतिबाधा माप एक लेबल मुक्त, गैर-आक्रामक और सेल स्थिति 3 के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देताहै। यहां हम रियल-टाइम सेलुलर एनालिसिस (आरटीसीए) सिस्टम के डिजाइन के आधार पर एक तीन-कक्षीय सरणी का वर्णन करते हैं जिसे अबासी एट अल.5 द्वारा विकसित किया गया था। तीन-कक्षीय सरणी सेलुलर आक्रमण पर सह-सुसंस्कृत कोशिकाओं के मूल्यांकन और अतिरिक्त विश्लेषण या विस्तार के लिए आक्रामक कोशिकाओं की वसूली की अनुमति देती है।

सेल विश्लेषक प्रणाली में, कोशिकाएं एक झरझरा झिल्ली पर लेपित एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण करती हैं और बाधा के विपरीत तरफ स्थित एक इंटरडिजिटेड इलेक्ट्रोड सरणी तक पहुंचती हैं। जैसा कि इनवेसिव कोशिकाएं समय के साथ इस इलेक्ट्रोड सरणी को संलग्न और कब्जा करना जारी रखती हैं, विद्युत प्रतिबाधा समानांतर में बदल जाती है। वर्तमान प्रणाली में दो कक्षों के साथ एक सेल आक्रमण और माइग्रेशन (सीआईएम) 16-अच्छी तरह से प्लेट शामिल है। RTCA-DP (दोहरे उद्देश्य) (जिसे आगे से दोहरी उद्देश्य सेल विश्लेषक कहा जाता है) उपकरण में प्रतिबाधा माप के लिए सेंसर होते हैं और प्रतिबाधा डेटा का विश्लेषण और संसाधित करने के लिए एकीकृत सॉफ़्टवेयर होते हैं। बेसलाइन पर प्रतिबाधा मान कुओं में मीडिया की आयनिक ताकत पर निर्भर करते हैं और कोशिकाओं को इलेक्ट्रोड से संलग्न करने के रूप में बदल दिया जाता है। प्रतिबाधा परिवर्तन कोशिकाओं की संख्या, उनकी आकृति विज्ञान, और इलेक्ट्रोड से जुड़ी कोशिकाओं की सीमा पर निर्भर करते हैं। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले मीडिया के साथ कुओं का एक माप पृष्ठभूमि संकेत के रूप में माना जाता है। इलेक्ट्रोड पर संलग्न और फैलने वाली कोशिकाओं के साथ संतुलन तक पहुंचने के बाद पृष्ठभूमि को प्रतिबाधा माप से घटाया जाता है। एक इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं की स्थिति का एक इकाईहीन पैरामीटर जिसे सेल इंडेक्स (सीआई) कहा जाता है, की गणना निम्नानुसार की जाती है: CI = (संतुलन के बाद प्रतिबाधा - कोशिकाओं की अनुपस्थिति में प्रतिबाधा) / नाममात्र प्रतिबाधा मान6। जब विभिन्न सेल लाइनों की माइग्रेशन दरों की तुलना की जाती है, तो डेल्टा सीआई का उपयोग पहले कुछ मापों में दर्शाए गए अनुलग्नक में अंतर की परवाह किए बिना सेल स्थिति की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

नए डिजाइन किए गए तीन-कक्षीय सरणी मौजूदा डिजाइन पर बनाता है और दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक प्रणाली से शीर्ष कक्ष का उपयोग करता है जिसमें इलेक्ट्रोड होते हैं। संशोधित मध्य और नीचे के कक्षों को एकीकृत सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रतिबाधा माप और विश्लेषण के लिए दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक में असेंबली को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। दो प्रमुख प्रगति जो नया डिज़ाइन मौजूदा दोहरे-कक्ष सीआईएम-प्लेट (जिसे सेल विश्लेषक प्लेट कहा जाता है) पर प्रदान करता है, वे हैं: i) पुनर्प्राप्त करने की क्षमता, और फिर आक्रामक सेल उप-आबादी का विश्लेषण करें जो विषम सेल मिश्रणों में मौजूद हैं और ii) सेल आक्रमण पर सह-सुसंस्कृत स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्रावित कारकों के प्रभाव का आकलन करने का विकल्प (चित्रा 1)।

यह तकनीक विभिन्न आक्रामक क्षमताओं के साथ कोशिकाओं की उप-आबादी का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकती है। इसमें (ए) आक्रामक कैंसर कोशिकाएं शामिल हैं जो आसपास के ऊतकों या रक्त और लसीका वाहिकाओं पर आक्रमण करती हैं या दूर के अंगों में मेटास्टैटिक सीडिंग साइटों पर अतिरिक्त होती हैं, (बी) प्रतिरक्षा प्रणाली से कोशिकाएं जो रोगजनकों या रोगग्रस्त कोशिकाओं से निपटने के लिए ऊतकों पर आक्रमण करती हैं, (सी) एंडोथेलियल कोशिकाएं जो ऊतक पुनर्गठन या घाव भरने के दौरान नई रक्त वाहिकाओं को बनाने के लिए ऊतकों पर आक्रमण करती हैं, साथ ही (डी) ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से स्ट्रोमल कोशिकाएं जो कैंसर कोशिकाओं के साथ-साथ समर्थन और आक्रमण करती हैं। दृष्टिकोण स्ट्रोमल क्रॉस-टॉक को शामिल करने की अनुमति देता है जो सेल गतिशीलता और आक्रमण को संशोधित कर सकता है। यहां दिखाए गए व्यवहार्यता अध्ययन कैंसर सेल आक्रमण और एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्ट्रोमा के साथ बातचीत पर केंद्रित इस संशोधित सरणी का उपयोग करते हैं, जिसमें कैंसर कोशिकाओं से अंतर संकेतों के जवाब में एंडोथेलियल आक्रमण शामिल है। कैंसर कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकारों जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, या एंडोथेलियल कोशिकाओं की उप-आबादी को अलग करने के लिए दृष्टिकोण को एक्सट्रपलेटेड किया जा सकता है। हमने सिद्धांत के प्रमाण के रूप में आक्रामक और गैर-आक्रामक स्थापित स्तन कैंसर सेल लाइनों का परीक्षण किया। हमने नैदानिक नैदानिक सेटिंग्स में भविष्य के उपयोग के लिए व्यवहार्यता दिखाने के लिए मानव अस्थि मज्जा से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जवाब में रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) आक्रमण से कोशिकाओं का भी उपयोग किया। पीडीएक्स रोगी ट्यूमर ऊतक हैं जो मूल रोगी 7,8 के लिए विकास, प्रगति और उपचार विकल्पों के अध्ययन की अनुमति देने के लिए इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड या मानवीकृत चूहों के मॉडल में प्रत्यारोपित किए जाते हैं।

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Protocol

जॉर्जटाउन विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # 2002-022) द्वारा अध्ययन की समीक्षा की गई और "छूट" के रूप में माना गया। ताजा काटे गए अस्थि मज्जा ऊतकों को त्याग दिए गए स्वस्थ मानव अस्थि मज्जा संग्रह फिल्टर से एकत्र किया गया था जिन्हें डी-पहचाना गया था।

1. नई कक्ष डिजाइन (चित्रा 2)

  1. एक नया दोहरी कक्ष सेल विश्लेषक प्लेट खोलें। इलेक्ट्रोड के साथ शीर्ष कक्ष को अलग रखें।
  2. एक मिलिंग मशीन का उपयोग करके, सेल विश्लेषक प्लेट के यू-आकार के नीचे के कुओं के 2 मिमी को बंद कर दें।
  3. यूवी-क्यूरेटेड चिपकने वाला का उपयोग करके मुंडा कुओं के नीचे 0.2 μm ताकना आकार के साथ एक 2 सेमी x 7 सेमी polyethersulfone (पीईएस) झिल्ली संलग्न करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट क्यूरेशन समय की अनुमति दें कि गोंद पूरी तरह से ठीक और निष्क्रिय है।
  4. एक मिलिंग मशीन का उपयोग करते हुए, नए गढ़े गए तीसरे कक्ष की लकीरों में स्नैप करने के लिए पक्षों के साथ दो अनुदैर्ध्य स्लिट्स (1.5 मिमी x 5.6 मिमी) को काट लें।
  5. एक मिलिंग मशीन का उपयोग करते हुए, एक तीसरा पॉली कार्बोनेट कक्ष बनाएं जो सेल विश्लेषक प्लेट के समग्र आयामों को दोहराता है; 72 मिमी x 18 मिमी (सामग्री की तालिका)।
  6. सेल विश्लेषक प्लेट के 16-अच्छी तरह से डिजाइन को दोहराने के लिए व्यास में 4.8 मिमी गहरे और 4.75 मिमी कुएं बनाएं। यह अच्छी तरह से प्रति मात्रा के 90 μL की अनुमति देता है.
  7. पक्षों पर, दो त्रिकोणीय लकीरें बनाएं ताकि कक्ष चरण 1.4 में बनाए गए मूल स्लिट्स में ताले लगा दे। त्रिभुज का क्षैतिज भाग 1.5 मिमी है, ऊर्ध्वाधर 1.4 मिमी है, और कर्ण 2.052 मिमी है।
  8. मूल प्लेट के पायदान (चित्रा 2, मध्य) में फिट होने के लिए व्यास में 50.8 मिमी और ऊंचाई में 1.397 मिमी है कि छोटी तरफ एक घुंडी बनाएँ।
  9. एक सील फिट प्रदान करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अच्छी तरह से के लिए एक 0.9 मिमी मोटी रबर वॉशर का उपयोग करें।

2. सेल संस्कृति (एमडीए-MB-231, DCIS, DCIS-Π4, J2-fibroblasts)

  1. 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ अनुयायी सेल संस्कृतियों (~ 70% संगम) को धोएं।
  2. कोशिकाओं को बंद करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान जोड़ें।
  3. सीरम युक्त सेल संस्कृति मीडिया के साथ ट्रिप्सिन समाधान को बेअसर करें और सेल निलंबन के एलीकोट का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट:: विशिष्ट कक्ष संस्कृति मीडिया तालिका 1 में पाया जा सकता है।

3. रोगी व्युत्पन्न पृथक्करण

  1. एक बाँझ scalpel का उपयोग कर ठीक mush में एक ताजा ट्यूमर टुकड़ा (1 सेमी2) काट लें।
  2. DMEM F12 मीडिया के 20 mL के साथ एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में जगह 3 मिलीग्राम / एमएल ट्रिप्सिन और 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस के साथ पूरक।
  3. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल शेकर (150 आरपीएम) में इनक्यूबेट करें।
  4. 5 मिनट के लिए 500 x g पर ट्यूब स्पिन; supernatant निकालें.
  5. कोशिकाओं को धोने के लिए DMEM F12 + 2% FBS के 20 μL जोड़ें; 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन और supernatant को हटाने. दो बार और धोएं।
  6. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए PDX मीडिया (तालिका 1) के 1 mL में पुन: निलंबित करें।

4. अस्थि मज्जा सेल निष्कर्षण

  1. अस्थि मज्जा (बीएम) संग्रह फिल्टर 1x PBS के 25 mL के साथ फ्लश करें।
    नोट:: इस अध्ययन में, PBS को फ़िल्टर में शेष BM एकत्र करने के लिए अस्पताल से एक प्रयुक्त BM संग्रह फ़िल्टर में जोड़ा गया था।
  2. फ्लश किए गए बीएम को धीरे-धीरे घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें, परतों को यथासंभव अलग रखने के लिए ध्यान रखें।
  3. 18 °C पर 20 मिनट के लिए 800 x g पर स्पिन करें
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन (वसा / प्लाज्मा) के बाद शीर्ष परतों को बंद कर दें और घनत्व ढाल माध्यम के ऊपर सफेद परत के 5 मिलीलीटर को स्थानांतरित करें जिसमें बीएम कोशिकाएं 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में होती हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 5 एमएल पिपेट को शीर्ष परत में डुबोएं जब तक कि यह मध्य परत (बीएम) को नहीं छूता है और पिपेट को स्थानांतरित किए बिना मध्य परत को बहुत धीरे-धीरे बाहर निकालता है।
  5. 1x PBS (~ 10 mL) के साथ 15 mL शंक्वाकार ट्यूब भरें और 15 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
  6. supernatant निकालें; शेष सफेद गोली बीएम है.
  7. यदि लाल रक्त कोशिकाओं को गोली में देखा जाता है, तो आरबीसी लाइसिस समाधान (सामग्री की तालिका) के 5 मिलीलीटर जोड़ें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए बैठने दें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन और supernatant को हटाने.
  8. कोशिकाओं को धोने के लिए 1x PBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें, 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें और supernatant को हटा दें। आरबीसी लाइसिस (चरण 4.7) को तब तक दोहराएं जब तक कि गोली सफेद न हो जाए।

5. सेल सीडिंग और असेंबली

  1. ऊतक संस्कृति हुड में सभी तीन बाँझ कक्षों जगह.
  2. निचले कक्ष के छोटे पक्ष पर घुंडी का पता लगाएं। निचले कक्ष को उन्मुख करें ताकि घुंडी प्रयोगकर्ता का सामना कर रही हो।
  3. निचले कक्ष के प्रत्येक कुएं में 90 μL मीडिया में 30,000-50,000 कोशिकाओं को जोड़ें। बुलबुले बनाने से बचें। ये स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं जो स्रावित कारक प्रदान करेंगी लेकिन शीर्ष कक्ष के इलेक्ट्रोड द्वारा पता नहीं लगाया जाएगा।
  4. सेल गतिशीलता के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में दो निचले कक्ष कुओं में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम-पूरक मीडिया का उपयोग करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 0% सीरम-पूरक मीडिया का उपयोग करें।
  5. कोशिकाओं के साथ निचले कक्ष को हुड में 10-15 मिनट तक बैठने दें।
    नोट:: यह चरण अनुशंसित है यदि कक्ष अनुयायी हैं या निलंबन में बढ़ते हैं।
  6. निचले कक्ष को 90° पर घुमाएं और मध्य कक्ष को शीर्ष पर रखें ताकि निचले कक्ष पर घुंडी मध्य कक्ष पर पायदान में स्लाइड हो जाए।
    नोट: निचले कक्ष पर घुंडी और मध्य कक्ष पर नीले बिंदु विधानसभा के विपरीत सिरों पर हैं।
  7. लंबवत नीचे पुश करें जब तक कि असेंबली के प्रत्येक लंबे पक्ष से एक क्लिक ध्वनि नहीं सुनी जाती है।
  8. मध्य कक्ष के सभी कुओं के लिए सीरम मुक्त मीडिया के 160 μL जोड़ें।
  9. सुनिश्चित करें कि कुओं के भरने के बाद एक गुंबद के आकार का मेनिस्कस दिखाई देता है; अन्यथा, पिपेट अंशांकन के आधार पर अंतिम मात्रा को समायोजित करें। बुलबुले बनाने से बचें।
  10. मध्य कक्ष पर नीचे का सामना करने वाले इलेक्ट्रोड के साथ शीर्ष कक्ष रखें, जिससे मध्य और शीर्ष कक्षों पर नीले डॉट्स को संरेखित करना सुनिश्चित हो सके।
  11. लंबवत नीचे पुश करें जब तक कि असेंबली के प्रत्येक लंबे पक्ष से एक क्लिक ध्वनि नहीं सुनी जाती है।
  12. शीर्ष कक्ष के लिए सीरम मुक्त मीडिया के 25-50 μL जोड़ें.
  13. ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक पर असेंबली माउंट करें और पृष्ठभूमि को मापने से पहले 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट:: यह समय सरणी को संतुलित करने के लिए आवश्यक है और शीर्ष कक्ष में जोड़े जाने के लिए सेल लाइनों को तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
  14. पृष्ठभूमि को मापें (अनुभाग 6 देखें) और असेंबली को ऊतक संस्कृति हुड में वापस रखें।
  15. शीर्ष कक्ष के प्रत्येक कुएं के लिए सीरम मुक्त मीडिया के 100 μL में 30,000-50,000 कोशिकाओं को जोड़ें। ये वे कोशिकाएं हैं जो झिल्ली के माध्यम से सफलतापूर्वक स्थानांतरित होने के बाद इलेक्ट्रोड का पता लगाएगी।
    नोट: अधिकतम प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए, परख करने से पहले 6-18 ज के लिए सीरम-मुक्त या कम सीरम मीडिया में कोशिकाओं को विकसित करने की सिफारिश की जाती है।
  16. प्रतिबाधा माप के लिए दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक पर बढ़ते से पहले असेंबली को 30 मिनट के लिए हुड में खड़े होने दें।

6. पृष्ठभूमि और प्रतिबाधा माप

  1. दोहरी उद्देश्य सेल विश्लेषक उपकरण में पालना में सरणी जगह.
  2. सेल विश्लेषक सॉफ़्टवेयर खोलें और उपयोग किए जाने वाले पालने का चयन करें।
  3. संदेश टैब पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि यह कहता है कि सरणी को पालने में अच्छी तरह से रखा गया है और इलेक्ट्रोड सेंसर के साथ अच्छी तरह से संरेखित हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कनेक्शन ठीक है।
  4. एक्सपेरिमेंट नोट्स टैब पर क्लिक करें और प्रयोग के बारे में अधिक से अधिक जानकारी भरें।
  5. लेआउट टैब पर क्लिक करें और सरणी लेआउट का विवरण भरें।
  6. शेड्यूल टैब पर क्लिक करें और चरण मेनू से दो चरण जोड़ें; एक पृष्ठभूमि कदम (एक स्वीप) और 100 स्वीप के साथ एक परीक्षण चरण-हर 15 मिनट में एक स्वीप, कुल 25 घंटे।
  7. सरणी 30 मिनट के लिए दोहरी उद्देश्य सेल विश्लेषक इनक्यूबेटर में किया गया है के बाद, पृष्ठभूमि माप शुरू करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें। डेटा को सहेजने के लिए फ़ोल्डर चुनने के लिए कहने वाली एक विंडो पॉप अप होगी।
  8. पृष्ठभूमि माप करने के बाद, सरणी को पालने से हटा दें और इसे सेल संस्कृति हुड में वापस रखें।
  9. चरण 5.13 में वर्णित शीर्ष कक्ष में कोशिकाओं को जोड़ें, और कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए 30 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति हुड में असेंबली रखें।
  10. दोहरी उद्देश्य कक्ष विश्लेषक में सरणी वापस रखें और कनेक्शन ठीक संदेश के लिए संदेश टैब की जाँच करें।
  11. प्रतिबाधा माप शुरू करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें।
  12. सिग्नल की प्रगति की निगरानी करने के लिए प्लॉट टैब पर क्लिक करें।
  13. यदि समापन बिंदु 25 घंटे से पहले तक पहुँच गया है, तो निष्पादन ड्रॉप-डाउन मेनू से निरस्त चरण पर क्लिक करें।
  14. डेटा निर्यात करने के लिए, ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करें, सूची स्वरूप में प्रतिलिपि बनाएँ चुनें, और तब डेटा को स्प्रेडशीट में चिपकाएँ.
    नोट:: डेटा कक्ष अनुक्रमणिका या डेल्टा कक्ष अनुक्रमणिका के रूप में निर्यात किया जा सकता है। ग्राफ़ और/या लेआउट जानकारी को निर्यात के लिए भी चुना जा सकता है।

7. टुकड़ी और सेल संग्रह

  1. ब्याज के स्टॉपिंग पॉइंट (6-18 ज) को निर्धारित करने के लिए दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक पर वास्तविक समय में माइग्रेशन दर की निगरानी करें।
    नोट:: रोक बिंदु सेल की आक्रमण दर पर निर्भर करता है और जब नकारात्मक नियंत्रण से एक अलग आक्रमण संकेत प्राप्त किया जाता है।
  2. एक बार प्राप्त करने के बाद, दोहरे उद्देश्य सेल विश्लेषक से असेंबली को अनमाउंट करें और इसे ऊतक संस्कृति हुड में रखें।
  3. ब्याज के कुओं से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की एक उपयुक्त संख्या तैयार करें।
  4. कक्षों के अलग होने पर तरल पदार्थ रखने के लिए असेंबली को 10 सेमी डिश में रखें।
  5. मध्य कक्ष के लंबे पक्ष पर लचीला स्नैपिंग अंत को अंदर की ओर धक्का दें जब तक कि एक क्लिक ध्वनि सुनाई न दे।
  6. शीर्ष कक्ष को विघटित करें और इसे एक नए 10 सेमी डिश में उलटें।
  7. एक ही प्रयोगात्मक स्थिति (यानी, सेल प्रकार, दवा उपचार, आदि) harboring सभी कुओं से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक 13 मिमी ब्लेड के साथ एक सेल भारोत्तोलक का उपयोग करें।
    नोट:: नकारात्मक नियंत्रण से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए कम से कम दो कुओं के लिए सेटअप डिज़ाइन करें।
  8. कुल्ला या 1x फॉस्फेट buffered खारा में ब्लेड डुबकी 1.5 mL microcentrifuge ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए.
  9. 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
  10. एकत्रित कोशिकाओं का प्रचार करें (अनुभाग 8 देखें) या एकल-सेल आरएनए-सेक जैसे अंत बिंदु विश्लेषण करें।
    नोट:: थोक RNA-seq के लिए, एक कम सेल संख्या RNA निष्कर्षण किट का उपयोग करें।

8.3D सेल प्रसार और पुनर्प्राप्ति

नोट: एकत्र की गई कोशिकाओं की छोटी संख्या के कारण, व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) का उपयोग करके 3 डी में कोशिकाओं को बीज दें। उस ने कहा, 2 डी संस्कृति भी इस बिंदु पर एक विकल्प है, खासकर अगर उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं स्थापित सेल लाइनों से हैं।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक एलीकोट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बर्फ पर रखें जब तक उपयोग करने के लिए तैयार है.
  2. इकट्ठा जीवित कोशिकाओं के छर्रे के लिए ठंडे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 25 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट। बुलबुले बनाने से बचें।
  3. सेल-बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण को एक छोटे से ऊतक संस्कृति के तल पर अच्छी तरह से जोड़ें (यानी, 96-अच्छी तरह से प्लेट में), एक गुंबद बनाते हैं। कोशिश करें कि कुएं की दीवारों को न छुएं। धीरे से मीडिया ड्रॉपवाइज के 100 μL जोड़ने से पहले 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करने के लिए, मीडिया को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μL डिस्पैज़ जोड़ें।
  5. 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, कभी-कभी ऊपर और नीचे पाइपिंग करें।
  6. कोशिकाओं और भंग तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स एक 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण. 1x PBS के 1 mL जोड़ें, 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन और supernatant निकालें। एक बार धोने को दोहराएं।
  7. Supernatant aspirate. छर्रे में कोशिकाओं को विभाजित करें या समापन बिंदु विश्लेषण करें।

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Representative Results

नए डिजाइन किए गए तीन-कक्षीय सरणी का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं के आक्रमण का परीक्षण फाइब्रोब्लास्ट ्स जैसे स्ट्रोमल कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया था। एमडीए-एमबी -231 सेल आक्रमण को बढ़ाया गया था जब विकिरणित स्विस 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट (जे 2 स्ट्रेन) को नीचे के कक्ष में बीज दिया गया था, जिससे दो सेल लाइनों के बीच कारकों के आदान-प्रदान की अनुमति मिलती थी। दिलचस्प बात यह है कि एमडीए-एमबी -231 आक्रमण में वृद्धि हुई जब 3T3-J2 कोशिकाओं को संख्या में दोगुना कर दिया गया (चित्रा 3 ए)। दूसरी ओर, MCFDCIS कोशिकाओं (DCIS-Π4)9 के एक आक्रामक क्लोन की आक्रमण दर 3T3-J2 कोशिकाओं (चित्रा 3B) के साथ क्रॉस-टॉक द्वारा बाधित प्रतीत होती है। यह डेटा स्ट्रोमा के अलग-अलग प्रभावों को मापने के लिए तीन-कक्षीय सरणी के उपयोगी अनुप्रयोग को दिखाता है, इस मामले में, फाइब्रोब्लास्ट, सेल आक्रमण पर।

इसके बाद, एंडोथेलियल कोशिकाओं में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए या तो आक्रामक (एमडीए-एमबी -231) 10,11 या गैर-इनवेसिव (डीसीआईएस) 12 कैंसर कोशिकाओं से संकेतों के जवाब में आक्रमण, मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी) जो रक्त वाहिकाओं की दीवारों को अस्तर करने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, का उपयोग किया गया था। एचयूवीईसी एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारकों के जवाब में अधिक आक्रामक थे, डीसीआईएस कोशिकाओं (चित्रा 4) द्वारा स्रावित लोगों के विपरीत। यह रक्त वाहिका गठन और बाद में परिसंचरण में प्रसार के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं को भर्ती करने के लिए आक्रामक ट्यूमर की क्षमता के अनुरूप है।

ऊपर दिए गए डेटा सेल लाइनों की विभिन्न आक्रमण दरों की निगरानी करने के लिए सेल विश्लेषक प्रणाली की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं; जब आक्रमण शुरू होता है, प्रगति करता है और पठार। यह उपयोगकर्ता को ब्याज के समय बिंदु को चुनने की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, आक्रमण के पहले 2-3 घंटे के बाद, अग्रणी कोशिकाओं को पकड़ने के लिए जो आक्रमण शुरू करते हैं और अनुयायी कोशिकाओं से अलग होते हैं जो सामूहिक आक्रमण द्वारा उसके बाद आक्रमण करते हैं।

जबकि उपरोक्त डेटा एक सह-संस्कृति सेटिंग में आक्रमण का निरीक्षण करने के लिए तीन-कक्षीय सरणी के उपयोग के लिए सिद्धांत का एक ठोस प्रमाण प्रदर्शित करता है, हम नैदानिक और नैदानिक सेटिंग्स में इस सरणी की संभावित प्रयोज्यता का परीक्षण करना चाहते थे। इसके लिए, मानव अस्थि मज्जा के नमूनों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) 8 सह-सुसंस्कृत से सेल निलंबन के आक्रमण की निगरानी की गई थी। कुल मानव अस्थि मज्जा प्रतिरक्षा कोशिकाओं (बीएम) को सीरम के साथ या बिना नीचे के कक्ष पर बीज दिया गया था। शीर्ष कक्ष से पीडीएक्स कोशिकाओं का आक्रमण सह-सुसंस्कृत बीएम प्रतिरक्षा कोशिकाओं (चित्रा 5) के जवाब में बढ़ गया। दिलचस्प बात यह है कि बीएम कोशिकाओं के साथ निचले कक्ष में 2% सीरम की उपस्थिति पीडीएक्स आक्रमण के लिए आवश्यक थी।

Figure 1
चित्र 1: सेल आक्रमण निगरानी और सेल संग्रह प्रणाली का वर्कफ़्लो. (A) Stroma कोशिकाओं को नीचे के कक्ष में जोड़ा जाता है जो एक मध्य कक्ष पर लगाया जाता है, जो एक सेल बाधा के रूप में कार्य करता है जो केवल घुलनशील कारकों के लिए पारगम्य है। (बी) प्रतिबाधा बायोसेंसर के साथ शीर्ष कक्ष सेल लाइन को निगरानी के लिए प्राप्त करता है। रीयल-टाइम आक्रमण तब तक रिकॉर्ड किया जाता है जब तक कि सेल संग्रह के लिए उपयोगकर्ता-निर्धारित समय बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है। (सी) विघटित शीर्ष कक्ष उलटा है, और कोशिकाओं को सेल लिफ्टर का उपयोग करके काटा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सरणी कक्षों और संशोधनों की छवियाँ। (A) सरणी बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले तीन कक्ष। इलेक्ट्रोड को आश्रय देने वाले शीर्ष कक्ष पर कोई संशोधन नहीं किया गया था। (बी) मध्य कक्ष कुओं से, 2 मिमी की ऊंचाई को काट दिया गया है और खुले तल से जुड़ी एक झिल्ली; अनुदैर्ध्य स्लिट्स (1.5 मिमी x 5.6 मिमी) को प्रत्येक पक्ष में जोड़ा गया था। (सी) निचले कक्ष (72 मिमी x 18 मिमी) 16-अच्छी तरह से डिजाइन को दोहराने के लिए गढ़ा गया; कुओं 4.8 मिमी गहरे हैं, और व्यास में 4.75 मिमी, त्रिभुज लकीरें (1.5 मिमी क्षैतिज x 1.4 मिमी ऊर्ध्वाधर) को मध्य कक्ष स्लिट्स में क्लिक करने के लिए पक्षों के साथ जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कैंसर सेल आक्रमण पर सह-सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रभाव। (ए) एमडीए-एमबी -231 सेल आक्रमण का वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण, अकेले या 3T3-J2 फाइब्रोब्लास्ट (नीचे कक्ष) के साथ सह-संस्कृति में। 3T3-J2 फाइब्रोब्लास्ट्स को या तो 30,000 या 60,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से बीज दिया गया था। (बी) डीसीआईएस-4 सेल आक्रमण का वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण, अकेले या 3T3-J2 फाइब्रोब्लास्ट (नीचे कक्ष) के साथ सह-संस्कृति में। ठोस वृत्त माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं; पतली बिंदीदार रेखाएं मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एंडोथेलियल सेल आक्रमण पर कैंसर कोशिकाओं का प्रभाव। HUVEC आक्रमण का वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण, अकेले, आक्रामक एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं (नीचे कक्ष) या गैर-इनवेसिव डीसीआईएस कोशिकाओं (नीचे कक्ष) के साथ सह-संस्कृति में। ठोस वृत्त माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं; पतली बिंदीदार रेखाएं मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेल्टा सेल सूचकांक समय पर प्रतिबाधा के लिए सामान्यीकृत = 1 ज. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) के सेल आक्रमण को अस्थि मज्जा प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत किया जाता है। पीडीएक्स (शीर्ष कक्ष) से विघटित एकल कोशिकाओं को मानव अस्थि मज्जा कोशिकाओं (नीचे कक्ष) के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था, और सीरम की उपस्थिति या अनुपस्थिति में समय के साथ उनके आक्रमण की निगरानी की गई थी। ठोस वृत्त माध्य का प्रतिनिधित्व करते हैं; पतली बिंदीदार रेखाएं मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। डेल्टा सेल इंडेक्स समय पर प्रतिबाधा के लिए सामान्यीकृत = 1 घंटे और 36 मिनट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मीडिया घटक सांद्रता/अनुपात
एमडीए-एमडी-231 मीडिया DMEM
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10%
J2 Fibroblasts मीडिया DMEM
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10%
DCIS मीडिया DMEM F12
हॉर्स सीरम (HS) 5%
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF) 20 ng/mL
इन्सुलिन 10 μg/mL
हाइड्रोकार्टिसोन 0.5 μg/mL
हैजा विष 100 ng/mL
PDX मीडिया DMEM F12
भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 2%
HEPES 1 मीटर
इंसुलिन ट्रांसफरिन सेलेनियम एथेनोलामाइन (आईटीएस) 10 μg/mL
हाइड्रोकार्टिसोन 0.5 μg/mL
गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) 1 mg/mL

तालिका 1: सेल संस्कृति मीडिया संरचना. तालिका MDA-MD-231 मीडिया, J2 Fibroblasts मीडिया, DCIS मीडिया, और PDX मीडिया की रचनाओं को सूचीबद्ध करती है।

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Discussion

हमने स्ट्रोमल कोशिकाओं की उपस्थिति में वास्तविक समय में सेल आक्रमण की निगरानी के लिए एक तीसरे कक्ष को शामिल करने के लिए एक दोहरे-कक्ष वाले सरणी के डिजाइन को संशोधित किया है। हमने आक्रामक और गैर-आक्रामक कैंसर कोशिकाओं पर सह-सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट के अलग-अलग प्रभावों को देखा है जो यह दर्शाता है कि सरणी का उपयोग कैंसर सेल उप-आबादी के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है जो सह-सुसंस्कृत स्ट्रोमल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कारकों के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया करते हैं। सरणी का उपयोग स्ट्रोमल ऊतकों में एंडोथेलियल सेल आक्रमण की निगरानी करने के लिए भी किया गया था, जो रक्त वाहिकाओं के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम था, जो अलग-अलग आक्रामक क्षमता वाले कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति में एंजियोजेनिक उत्तेजना की ओर अंकुरित होता है। ये प्रयोग कैंसर सेल या अन्य सेल अलगाव के लिए सरणी के बहुमुखी उपयोग को दिखाते हैं।

प्रत्येक कक्ष में जोड़े जाने वाले कक्षों की संख्या को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभव और निर्माता की सिफारिश से, 30,000-50,000 कोशिकाएं इष्टतम हैं। चूंकि इस सरणी में दो सेल प्रकारों को सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिनमें से एक स्ट्रोमा कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति हो सकती है, इसलिए व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं पर विभिन्न मीडिया के प्रभावों की निगरानी करने का सुझाव दिया जाता है। हमने पाया कि निगरानी की जाने वाली कोशिकाओं की भुखमरी प्रतिकृतियों के बीच भिन्नता को कम करती है। यदि सीरम-मुक्त विकास की स्थिति कोशिकाओं के लिए हानिकारक है, तो कम सीरम और कम भुखमरी के समय का उपयोग किया जा सकता है। एक कम सीरम राशि (1% -2%) के अलावा नीचे कक्ष में स्ट्रोमल कोशिकाओं (प्राथमिक कोशिकाओं) के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, फिर भी डेटा व्याख्या के लिए उचित नियंत्रण स्थितियों को शामिल करना सुनिश्चित करें (यानी, स्ट्रोमल कोशिकाओं के साथ और बिना 2% सीरम)। यदि आक्रमण की दर कम है, तो प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार अधिक कुएं डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र की गई व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं। रोगी बायोप्सी का विश्लेषण करते समय, सेल विश्लेषक प्लेट पर परीक्षण करने से पहले एकल कोशिकाओं में ऊतक का विघटन महत्वपूर्ण है। सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए विघटन की स्थिति का अनुकूलन आक्रमण विश्लेषण करने से पहले एक महत्वपूर्ण कदम है। आक्रमण के अतिरिक्त पहलुओं का अध्ययन करना भी संभव है, जैसे कि दवा के उपचार के प्रति संवेदनशीलता या आक्रमण दर पर बाह्य कोशिकीय तहखाने मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों का प्रभाव। ईसीएम माइक्रोएन्वायरमेंट का एक आवश्यक घटक है और सेल आक्रमण13 के दौरान एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है। कई प्रकाशित अध्ययनों ने ईसीएम का उपयोग शीर्ष कक्ष को कोट करने के लिए किया है, इससे पहले कि आक्रामक कोशिकाओं को विभिन्न ईसीएमघटकों 14,15 के साथ उनकी बातचीत की निगरानी करने के लिए जोड़ा जाए। तीन-कक्षीय सरणी आक्रामक और स्ट्रोमा कोशिकाओं के बीच सह-संस्कृति इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। जबकि प्रस्तावित डिज़ाइन किसी भी स्ट्रोमल कोशिकाओं के बिना आक्रामक कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सेल संग्रह की गारंटी देता है, यह सेटअप इष्टतम नहीं हो सकता है यदि कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक को विभिन्न सेल प्रकारों की भौतिक बातचीत की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, गैर-अनुयायी कोशिकाएं जो निलंबन में बढ़ती हैं, उन्हें यहां प्रस्तावित तरीकों (स्क्रैपिंग) में एकत्र नहीं किया जा सकता है, फिर भी एक अलग दृष्टिकोण जिसमें गैर-अनुयायी कोशिकाओं वाले विघटित कक्षों में मीडिया को गैर-अनुयायी कोशिकाओं को काटने के लिए एकत्र किया जा सकता है।

जबकि इस सरणी का उपयोग अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए किया जा सकता है जो एक स्ट्रोमल घटक की उपस्थिति में सेल आक्रमण की निगरानी करते हैं, यहां हमने कैंसर सेल आक्रमण पर ध्यान केंद्रित किया है और यह दृष्टिकोण विषम जैविक नमूनों में मौजूद घातक कैंसर सेल उप-आबादी को कैसे उजागर कर सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली तीन-कक्षीय सरणी की नई क्षमता विषम कैंसर सेल मिश्रण से इनवेसिव उप-आबादी को अलग करने के लिए एक कार्यात्मक परख प्रदान करती है जिसमें अधिक और कम आक्रामक कैंसर कोशिकाएं होती हैं। आक्रामक और परिणाम-प्रासंगिक कैंसर सेल उप-आबादी का विश्लेषण उचित यंत्रवत अध्ययन और आणविक अंतर्दृष्टि के लिए आवश्यक है जो मिश्रित सेल आबादी के विश्लेषण द्वारा प्राप्त या पक्षपाती नहीं है। स्ट्रोमल कोशिकाओं के लिए सह-संस्कृति कक्ष इनवेसिव बीमारी की प्रगति के दौरान ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में सेल-सेल क्रॉस-टॉक में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

ऊतक के नमूनों के लिए आवेदन की दिशा में एक कदम के रूप में, उदाहरण के लिए, रोगियों से ट्यूमर बायोप्सी, हमने कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया जो रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर (पीडीएक्स) से अलग थे और ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण पर मानव अस्थि मज्जा कोशिकाओं के प्रभाव का परीक्षण किया। हम डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पीडीएक्स में मौजूद आक्रामक कोशिकाओं को इकट्ठा करने में सक्षम थे, यानी, आरएनए-सेक। PDXs assaying रोगियों से प्राप्त ट्यूमर बायोप्सी में कैंसर कोशिकाओं के विषम मिश्रण में मौजूद सेल उप-आबादी का विश्लेषण करने की दिशा में प्रारंभिक कदम है। अंतिम लक्ष्य इस तरह के ट्यूमर बायोप्सी का उपयोग करना और कैंसर कोशिकाओं की उप-आबादी को अलग करना होगा जो आक्रमण करते हैं और इस प्रकार मेटास्टैटिक प्रसार के लिए उनकी क्षमता के कारण खराब परिणामों को चलाते हैं। आणविक विशेषताओं की पहचान और दवा उपचार के लिए इन इनवेसिव उप-आबादी की संवेदनशीलता का परीक्षण करना भविष्य के अनुप्रयोग हैं।

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Disclosures

जॉर्जटाउन विश्वविद्यालय ने इस पांडुलिपि में वर्णित कुछ दृष्टिकोणों से संबंधित एक पेटेंट दायर किया। G.M.S, A.W., L.D. और M.P. को इस आवेदन पर आविष्कारकों के रूप में नामित किया गया है और इसे हितों के संभावित संघर्ष के रूप में घोषित किया गया है।

Acknowledgments

हम डॉ अलाना वेल्म्स, हंट्समैन कैंसर इंस्टीट्यूट, यूटा विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं, जो हमें रोगी-व्युत्पन्न (एचसीआई -010) प्रदान करने के लिए है। इस काम को एनआईएच अनुदान R01CA205632, R21CA226542, और भाग में, Agilent Technologies से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher 25300-054
Adhesive Norland Optical Adhesive NOA63
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell lifter Sarstedt 83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Thermofisher 12585-014
CIM-plate Agilent 5665817001 Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130
Dispase StemCell 7913
DMEM Thermofisher 11995-065
DMEM-F12 Thermofisher 11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
HEPES Thermofisher 15630106
Horse serum (HS) Gibco 16050-122
Human EGF Peprotech AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) LONZA (RRID:CVCL_2959) C-2517A
HUVEC media LONZA CC-3162
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) Thermofisher 51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution Sigma C8052
J2 Fibroblasts Stemcell (RRID:CVCL_W667) 100-0353
LymphoPrep Stemcell 7851 Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel Corning 354230 Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS) RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells RRID:CVCL_0062
Milling machine Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x) Thermofisher 10010049
Polyethersulfone (PES) membrane Sterlitech PCTF029030
RBC lysis solution Stemcell 7800
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004
RTCA DP analyzer Agilent 3X16 Dual purpose cell analyzer
Trypsin Sigma T4799

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 181
वास्तविक समय का पता लगाने और सह संस्कृतियों से इनवेसिव सेल Subpopulations के कैप्चर
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Sharif, G. M., Der, L., Riegel, A. T., Paranjape, M., Wellstein, A. Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures. J. Vis. Exp. (181), e63512, doi:10.3791/63512 (2022).

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