Summary
우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.
Abstract
암세포의 침윤 및 전이성 확산은 암으로 인한 사망의 주요 원인입니다. 암 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 상이한 침습적 잠재력을 갖는 암 세포 하위집단을 구별하지 않는 단일 종점 측정을 생성한다. 또한, 종양 미세환경은 암세포의 침습적 거동을 변화시키고 참여하는 상이한 상주 기질 및 면역 세포로 구성된다. 조직으로의 침윤은 또한 조직 리모델링 및 혈관형성 동안 미생물을 방어하거나 실질 및 내피 세포로부터 병든 세포를 제거하는 면역 세포 하위 집단에서 중요한 역할을 한다. 임피던스 바이오센서를 활용하여 세포 침윤을 모니터링하는 실시간 세포 분석(RTCA)은 침윤의 종점 측정을 넘어 중요한 진전이었습니다: 이는 시간이 지남에 따라 지속적인 측정을 제공하므로 종점 분석에서 손실되는 침윤율의 차이를 나타낼 수 있습니다. 현재의 RTCA 기술을 사용하여, 우리는 기질 및 / 또는 면역 세포를 포함 할 수있는 챔버를 추가로 추가하여 이중 챔버 어레이를 확장했으며 시간이 지남에 따라 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포에서 분비 된 인자의 영향으로 침윤 속도를 측정 할 수 있습니다. 이 외에도, 독특한 디자인은 언제든지 챔버를 분리하고 가장 침습적 인 암 세포 또는 테스트 된 종양 분리 물의 이종 혼합물에 존재하는 다른 세포 하위 집단을 분리 할 수있게합니다. 이러한 가장 침습적 인 암세포 및 기타 세포 하위 집단은 전이성 질환으로의 악성 진행을 유도하며, 분자 특성은 심층적 인 기계론 연구, 탐지를위한 진단 프로브 개발 및 취약성 평가에 중요합니다. 따라서, 소분자 또는 거대 분자 약물의 포함은 침습적 행동을 억제(예를 들어, 암 세포) 또는 증강(예를 들어, 면역 세포)하는 것을 목표로 암 및/또는 기질 세포 하위집단을 표적으로 하는 치료법의 잠재력을 시험하는데 사용될 수 있다.
Introduction
세포 침윤은 세포가 기질 세포에 의해 제공되는 환경 단서에 반응하여 기저막 장벽을 통과 할 수있게 해주는 중요한 과정입니다. 면역 반응, 상처 치유, 조직 복구 및 국소 병변에서 침습성 및 전이성 암으로 진행될 수있는 악성 종양을위한 개발의 여러 단계에서 중요한 단계입니다1. 세포 집단의 침습적 잠재력을 측정하기 위해 초기에 개발된 어세이는 전형적으로 단일 종점 측정을 생성하거나 침습성 세포의 사전 표지를 필요로한다2. 마이크로 일렉트로닉스 및 미세 유체 공학 기술의 통합은 이제 마이크로 전극 3,4에서 살아있는 세포의 전기 임피던스를 사용하여 생존력, 이동 및 부착과 같은 세포 생물학의 다양한 측면을 감지하기 위해 개발되었습니다. 임피던스 측정은 세포 상태에 대한 라벨 프리, 비침습적 및 정량적 평가를 가능하게한다3. 여기에서는 Abassi et al.5에 의해 개발 된 RTCA(Real-Time Cellular Analysis) 시스템의 설계를 기반으로 한 3개의 챔버 어레이에 대해 설명합니다. 세 개의 챔버형 어레이는 추가적인 분석 또는 확장을 위해 침습적 세포의 세포 침윤 및 회복에 대한 공동 배양된 세포의 평가를 가능하게 한다.
세포 분석기 시스템에서, 세포는 다공성 막 상에 코팅된 세포외 매트릭스를 통해 침범하여 장벽의 반대편에 위치하는 인터디지타이징된 전극 어레이에 도달한다. 침습 셀이 시간이 지남에 따라 이 전극 어레이를 계속 부착하고 점유함에 따라 전기 임피던스가 병렬로 변합니다. 현재 시스템은 두 개의 챔버를 갖는 세포 침윤 및 이동(CIM) 16-웰 플레이트를 포함한다. RTCA-DP(이중 목적)(이중 목적 셀 분석기라고 함) 계측기에는 임피던스 측정용 센서와 임피던스 데이터를 분석하고 처리하기 위한 통합 소프트웨어가 포함되어 있습니다. 기준선에서의 임피던스 값은 웰 내의 매체의 이온 강도에 의존하며, 전지가 전극에 부착될 때 변화된다. 임피던스 변화는 셀의 수, 그 형태 및 셀이 전극에 부착되는 정도에 따라 달라집니다. 세포가 추가되기 전에 배지를 가진 웰의 측정은 배경 신호로 간주됩니다. 배경은 전극에 부착되고 확산되는 셀과 평형에 도달 한 후 임피던스 측정에서 뺍니다. 전극 상의 셀 상태에 대한 무단위 파라미터는 셀 인덱스(CI)로 명명된다: CI = (평형 후 임피던스 - 셀의 부재 하에서의 임피던스)/공칭 임피던스 값6. 상이한 세포주의 이동 속도가 비교될 때, 델타 CI는 처음 몇 번의 측정에서 표현되는 부착의 차이에 관계없이 세포 상태를 비교하는데 사용될 수 있다.
새로 설계된 세 개의 챔버 어레이는 기존 설계를 기반으로 하며 전극이 포함된 이중 용도 셀 분석기 시스템의 상단 챔버를 사용합니다. 수정된 중간 및 하단 챔버는 통합 소프트웨어를 사용하여 임피던스 측정 및 분석을 위해 조립품을 이중 용도 셀 분석기에 적합하도록 조정됩니다. 새로운 설계가 기존의 이중 챔버 CIM-플레이트 (이후 세포 분석기 플레이트라고 함)를 통해 제공하는 두 가지 주요 진보는 i) 이종 세포 혼합물에 존재하는 침습적 세포 하위 집단을 회수 한 다음 분석 할 수있는 능력 및 ii) 공동 배양 된 기질 또는 면역 세포로부터 분비 된 인자가 세포 침윤에 미치는 영향을 평가하는 옵션 (그림 1).
이 기술은 다른 침습적 능력을 가진 세포의 하위 집단을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 여기에는 (a) 주변 조직이나 혈액 및 림프관을 침범하거나 먼 장기의 전이성 시딩 부위에서 혈관을 침범하는 침습성 암세포, (b) 병원균 또는 병든 세포를 다루기 위해 조직을 침범하는 면역계로부터의 세포, (c) 조직 재구성 또는 상처 치유 중에 새로운 혈관을 형성하기 위해 조직을 침범하는 내피 세포, 뿐만 아니라 (d) 종양 미세환경으로부터의 기질 세포는 암 세포와 함께 지지하고 침범한다. 이 접근법은 세포 운동성과 침윤을 조절할 수있는 기질 교차 대화의 포함을 허용합니다. 여기에 제시된 타당성 연구는 암 세포로부터의 차등 신호에 반응하여 내피 침윤을 포함하는 모델 시스템으로서 암 세포 침윤 및 스트로마와의 상호작용에 초점을 맞춘 이 변형된 어레이를 사용한다. 상기 접근법은 암 세포 및 다른 세포 유형, 예컨대 면역 세포, 섬유아세포, 또는 내피 세포의 하위집단을 분리하기 위해 외삽될 수 있다. 우리는 원칙의 증거로 침습적이고 비 침습적 인 확립 된 유방암 세포주를 테스트했습니다. 우리는 또한 인간 골수의 면역 세포에 반응하여 환자 유래 이종이식편 (PDX) 침윤의 세포를 사용하여 임상 진단 설정에서도 향후 사용에 대한 타당성을 보여주었습니다. PDX는 원래 환자(7,8)에 대한 성장, 진행 및 치료 옵션의 연구를 허용하기 위해 면역저하 또는 인간화 마우스 모델에 이식되는 환자 종양 조직이다.
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Protocol
이 연구는 조지 타운 대학의 기관 검토위원회 (IRB # 2002-022)에 의해 검토되고 "면제"로 간주되었습니다. 갓 수확한 골수 조직은 폐기된 건강한 인간 골수 수집 필터로부터 수집되었으며, 이는 비확인되었다.
1. 새로운 약실 디자인 (그림 2)
- 새로운 이중 챔버 셀 분석기 플레이트를 엽니다. 전극이있는 상단 챔버를 따로 두십시오.
- 밀링 머신을 사용하여 셀 분석기 플레이트의 U 자형 바닥 웰 2mm를 면도합니다.
- 0.2μm 기공 크기를 갖는 2cm x 7cm 폴리에테르술폰(PES) 멤브레인을 UV 경화 접착제를 사용하여 면도된 웰의 바닥에 부착한다. 접착제가 완전히 경화되고 불활성인지 확인하기 위해 30 분의 큐레이션 시간을 허용하십시오.
- 밀링 머신을 사용하여 측면을 따라 두 개의 세로 슬릿 (1.5mm x 5.6mm)을 잘라 새로 제작 된 세 번째 챔버의 능선에 스냅합니다.
- 밀링 머신을 사용하여 셀 분석기 플레이트의 전체 치수를 복제하는 세 번째 폴리 카보네이트 챔버를 만듭니다. 72 mm x 18 mm (재료 테이블).
- 깊이 4.8mm, 직경 4.75mm의 웰을 만들어 세포 분석기 플레이트의 16웰 설계를 복제합니다. 이를 통해 웰당 90μL의 부피가 허용됩니다.
- 측면에는 두 개의 삼각형 능선을 만들어 챔버가 1.4단계에서 만든 원래 슬릿에 고정되도록 합니다. 삼각형의 수평 부분은 1.5mm, 수직은 1.4mm, hypotenuse는 2.052mm입니다.
- 짧은 면에 직경 50.8mm, 높이 1.397mm의 손잡이를 만들어 원래 플레이트의 노치에 맞춥니다(그림 2, 가운데).
- 각 웰에 0.9mm 두께의 고무 와셔를 사용하여 밀폐된 핏을 제공합니다.
2. 세포 배양 (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-섬유아세포)
- 부착성 세포 배양물(∼70% 합류)을 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척한다.
- 0.05 % 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 들어 올립니다.
- 트립신 용액을 혈청을 함유하는 세포 배양 배지로 중화시키고, 세포 현탁액의 분취량을 사용하여 세포를 계수한다.
주: 특정 세포 배양 배지는 표 1에서 확인할 수 있다.
3. 환자 유래 이종이식편 해리
- 멸균 메스를 사용하여 신선한 종양 조각 (1cm2)을 미세한 버섯으로 자릅니다.
- 3mg/mL 트립신과 2mg/mL 콜라게나제가 보충된 DMEM F12 배지 20mL가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 넣으십시오.
- 20분 동안 37°C에서 열 진탕기(150 RPM)에서 인큐베이션한다.
- 튜브를 5분 동안 500 x g 에서 회전시키고; 상층액을 제거하십시오.
- 20 μL의 DMEM F12 + 2% FBS를 첨가하여 세포를 세척하는 단계; 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 제거하였다. 세척을 두 번 더 반복하십시오.
- 세포를 계수하기 위해 PDX 배지 1 mL (표 1)에 재현탁시켰다.
4. 골수 세포 추출
- 골수 (BM) 수집 필터를 25 mL의 1x PBS로 플러시하십시오.
참고: 본 연구에서, PBS는 필터에 남아있는 BM을 수집하기 위해 병원에서 사용된 BM 수집 필터에 첨가되었다. - 플러싱된 BM을 25 mL의 밀도 구배 매질이 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 천천히 첨가하고, 가능한 한 층들을 분리되도록 주의한다.
- 18°C에서 20분 동안 800 x g 에서 스핀
- 원심분리 후 최상층(지방/플라즈마)을 사이펀 분리하고 BM 세포가 있는 밀도 구배 배지 위의 흰색 층 5mL를 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
참고: 또는 5mL 피펫을 중간 층(BM)에 닿을 때까지 최상층에 담그고 피펫을 움직이지 않고 중간층을 매우 천천히 피펫 밖으로 내뿜습니다. - 15 mL 원뿔형 튜브를 1x PBS (∼10 mL)로 채우고 300 x g 에서 15 분 동안 회전시킨다.
- 상청액을 제거하고; 나머지 백색 펠릿은 BM이다.
- 펠렛에서 적혈구가 관찰되면 RBC 용해 용액 5mL (표 재료)를 넣고 실온에서 5 분 동안 그대로 두십시오 (RT). 300 x g 에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 제거하였다.
- 세포를 세척하기 위해 1x PBS 10 mL를 첨가하고, 300 x g 에서 5분 동안 스핀하고, 상청액을 제거하였다. 펠릿이 백색이 될 때까지 RBC 용해를 반복한다 (단계 4.7).
5. 세포 시딩 및 조립
- 세 개의 멸균 챔버를 모두 조직 배양 후드에 놓습니다.
- 하부 챔버의 짧은 쪽에 손잡이를 찾습니다. 손잡이가 실험자를 향하도록 아래쪽 챔버의 방향을 맞춥니다.
- 90 μL의 배지에 30,000-50,000 세포를 하부 챔버의 각 웰에 첨가한다. 거품을 형성하지 마십시오. 이들은 분비 된 인자를 제공 할 것이지만 상부 챔버의 전극에 의해 검출되지 않을 기질 세포입니다.
- 세포 운동성에 대한 양성 대조군으로 두 개의 하부 챔버 웰에 5% 소 태아 혈청이 보충된 배지를 사용하십시오. 0% 혈청이 보충된 배지를 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 세포가있는 하부 챔버를 후드에 10-15 분 동안 앉아서 정착시킵니다.
참고: 이 단계는 세포가 부착되어 있거나 현탁액에서 자라는 경우에 권장됩니다. - 아래쪽 챔버를 90°로 회전하고 중간 챔버를 위쪽에 배치하여 아래쪽 챔버의 노브가 중간 챔버의 노치로 미끄러지도록 합니다.
참고: 하부 챔버의 노브와 중간 챔버의 파란색 점은 어셈블리의 반대쪽 끝에 있습니다. - 어셈블리의 긴 측면 각각에서 클릭 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 누릅니다.
- 160μL의 무혈청 배지를 중간 챔버의 모든 웰에 첨가한다.
- 우물이 채워진 후에 돔 모양의 반월 연골이 보이는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 피펫 보정에 따라 최종 볼륨을 조정하십시오. 거품을 형성하지 마십시오.
- 전극이 중간 챔버에 아래쪽을 향하도록 하여 중간 챔버와 상단 챔버에 파란색 점을 정렬합니다.
- 어셈블리의 긴 측면 각각에서 클릭 소리가 들릴 때까지 수직으로 아래로 누릅니다.
- 25-50 μL의 무혈청 배지를 상부 챔버에 첨가하십시오.
- 조립체를 조직 배양 인큐베이터의 이중 용도 세포 분석기에 장착하고 배경을 측정하기 전에 30분 동안 기다렸다.
참고: 이 시간은 어레이를 평형화하는 데 필요하며 상부 챔버에 추가될 세포주를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. - 배경을 측정하고(섹션 6 참조) 조립체를 조직 배양 후드에 다시 배치합니다.
- 100 μL의 무혈청 배지에 30,000-50,000 세포를 상부 챔버의 각 웰에 첨가한다. 이들은 전극이 멤브레인을 통해 성공적으로 이동하면 감지 할 세포입니다.
참고: 최대 반응을 달성하려면 분석을 수행하기 전에 6-18시간 동안 무혈청 또는 저혈청 배지에서 세포를 성장시키는 것이 좋습니다. - 임피던스 측정을 위해 이중 용도 셀 분석기에 장착하기 전에 조립품을 후드에 30분 동안 방치하십시오.
6. 배경 및 임피던스 측정
- 어레이를 이중 목적 셀 분석기 장비의 크래들에 배치합니다.
- 셀 분석기 소프트웨어를 열고 사용할 크래들을 선택합니다.
- 메시지 탭을 클릭하고 어레이가 크래들에 잘 배치되고 전극이 센서와 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 연결 확인이라고 표시되는지 확인하십시오.
- 실험 노트 탭을 클릭하고 실험 에 대한 정보를 최대한 많이 입력합니다.
- 레이아웃 탭을 클릭하고 배열 레이아웃에 대한 설명을 입력합니다.
- 일정 탭을 클릭하고 단계 메뉴에서 두 단계를 추가하십시오. 배경 스텝 (1 스윕)과 100 스윕이있는 테스트 단계 - 15 분마다 스윕, 총 25 시간.
- 어레이가 이중 목적 세포 분석기 인큐베이터에서 30 분 동안 진행된 후 재생 버튼을 클릭하여 배경 측정을 시작하십시오. 데이터를 저장할 폴더를 선택하라는 창이 나타납니다.
- 배경 측정이 완료되면 크래들에서 어레이를 제거하고 세포 배양 후드에 다시 놓습니다.
- 단계 5.13에 기술된 바와 같이 세포를 상부 챔버에 첨가하고, 세포가 침전되도록 조직 배양 후드에서 30분 동안 조립체를 유지한다.
- 어레이를 이중 용도 셀 분석기에 다시 배치하고 메시지 탭에서 연결 확인 메시지를 확인합니다 .
- 재생 버튼을 클릭하여 임피던스 측정을 시작합니다.
- 플롯 탭을 클릭하여 신호의 진행률을 모니터링합니다.
- 끝점이 25시간 이전에 도달하면 실행 드롭다운 메뉴에서 중단 단계를 클릭합니다.
- 데이터를 내보내려면 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 목록 형식으로 복사 를 선택한 다음 스프레드시트에 데이터를 붙여 넣습니다.
참고: 데이터는 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스로 내보낼 수 있습니다. 그래프 및/또는 레이아웃 정보도 내보내기를 위해 선택할 수 있습니다.
7. 분리 및 세포 수집
- 이중 목적 셀 분석기에서 실시간으로 이동 속도를 모니터링하여 관심 지점(6-18h)을 확인합니다.
참고: 정지 지점은 셀의 침범 속도와 네거티브 컨트롤에서 뚜렷한 침범 신호가 도달하는 시기에 따라 달라집니다. - 일단 달성되면, 이중 목적 세포 분석기로부터 조립체를 마운트 해제하고 이를 조직 배양 후드에 놓는다.
- 관심있는 웰로부터 세포를 수집하기 위해 적절한 수의 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브를 준비한다.
- 챔버가 분리 될 때 액체가 들어있도록 조립품을 10cm 접시에 넣으십시오.
- 딸깍 소리가 들릴 때까지 중간 챔버의 긴 쪽에 있는 유연한 스냅 끝을 안쪽으로 밀어 넣습니다.
- 상단 챔버를 분해하고 새로운 10cm 접시로 뒤집습니다.
- 13mm 블레이드가 있는 세포 리프터를 사용하여 동일한 실험 조건(즉, 세포 유형, 약물 치료 등)을 보유하는 모든 웰로부터 세포를 수집합니다.
참고: 각 실험 조건에 대해 두 개 이상의 웰이 있어야 음성 대조군에서 통계적으로 유의한 변화를 얻을 수 있도록 설정을 설계하십시오. - 블레이드를 헹구거나 1x 인산염 완충 식염수에 담그고 세포를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 모은다.
- 세포를 500 x g 에서 5 분 동안 회전시킵니다.
- 수집된 세포를 전파하거나(섹션 8 참조) 단일 세포 RNA-seq와 같은 종말점 분석을 수행한다.
참고: 벌크 RNA-seq의 경우, 낮은 세포 수 RNA 추출 키트를 사용하십시오.
8.3D 세포 증식 및 회수
참고: 수집된 세포 수가 적기 때문에 생존력을 향상시키기 위해 세포외 매트릭스(ECM)를 사용하여 세포를 3D로 시드합니다. 즉, 2D 배양은 특히 사용 된 세포가 확립 된 세포주에서 나온 경우이 시점에서 옵션입니다.
- 기저막 매트릭스의 분취량을 4°C에서 하룻밤 사이에 해동시킨다. 사용할 준비가 될 때까지 기저막 매트릭스를 얼음 위에 보관하십시오.
- 25 μL의 차가운 기저막 매트릭스를 수집된 살아있는 세포의 펠릿에 첨가하고, 부드럽게 위아래로 피펫을 혼합한다. 거품을 형성하지 마십시오.
- 세포-기저막 매트릭스 믹스를 작은 조직 배양 웰의 바닥에(즉, 96-웰 플레이트에서) 추가하여, 돔을 형성한다. 우물의 벽을 만지지 마십시오. 100 μL의 배지를 부드럽게 적가하기 전에 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 회수하려면 배지를 흡인하고 각 웰에 100μL의 디스파아제를 첨가한다.
- RT에서 10 분 동안 인큐베이션하고 가끔씩 위아래로 피펫팅하십시오.
- 세포 및 용해된 기저막 매트릭스를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내로 옮긴다. 1 mL의 1x PBS를 첨가하고, 300 x g 에서 5분 동안 스핀하고, 상청액을 제거하였다. 세탁을 한 번 반복하십시오.
- 상층액을 흡인하십시오. 펠릿에서 세포를 분할하거나 종점 분석을 수행합니다.
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Representative Results
새로 설계된 삼챔버형 어레이를 사용하여, 섬유아세포와 같은 기질 세포의 존재 또는 부재 하에 세포의 침윤을 시험하였다. MDA-MB-231 세포 침윤은 조사된 스위스 3T3 섬유아세포(J2 균주)를 하부 챔버에 시딩할 때 강화되었고, 두 세포주 사이의 인자 교환을 허용하였다. 흥미롭게도, MDA-MB-231 침윤은 3T3-J2 세포 수가 두 배로 증가했을 때 증가하였다(도 3A). 한편, MCFDCIS 세포(DCIS-Δ4)9 의 침습성 클론의 침윤 속도는 3T3-J2 세포와의 상호작용에 의해 억제되는 것으로 보인다(도 3B). 이 데이터는 세포 침윤에 대한 스트로마, 이 경우, 섬유아세포의 다양한 효과를 측정하기 위해 삼챔버 어레이의 유용한 적용을 보여준다.
다음으로, 침습성 (MDA-MB-231)10,11 또는 비침습성 (DCIS)12 암 세포로부터의 신호에 반응하여 내피 세포의 운동성 및 침윤성의 변화를 모니터링하기 위해, 혈관벽을 감싸는 내피 세포를 나타내는 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVECs)를 사용하였다. HUVECs는 DCIS 세포에 의해 분비되는 것과 달리 MDA-MB-231 세포에 의해 분비되는 인자에 반응하여 더 침습적이었다(도 4). 이것은 혈관 형성을 위해 내피 세포를 모집하고 나중에 순환으로 보급하는 침습성 종양의 능력과 일치합니다.
상기 데이터는 세포주의 상이한 침윤 속도를 모니터링하는 세포 분석기 시스템의 능력을 입증한다; 침략이 시작되면 진행하고 고원화됩니다. 이를 통해 사용자는 관심 지점, 예를 들어 처음 2-3 시간의 침공 후, 침입을 시작하는 개척자 세포를 캡처하고 그 후에 집단 침공에 의해 침입하는 추종자 세포와 구별됩니다.
위의 데이터는 공동 배양 환경에서 침입을 관찰하기 위해 세 개의 챔버 배열을 사용하는 것에 대한 확실한 원리 증명을 보여 주지만, 우리는 임상 및 진단 설정에서이 배열의 잠재적 유용성을 테스트하고자했습니다. 이를 위해, 인간 골수 샘플로부터의 면역 세포와 공동 배양된 환자 유래 이종이식편(PDX)8 로부터의 세포 현탁액의 침윤을 모니터링하였다. 총 인간 골수 면역 세포 (BM)를 혈청이 있거나 없는 바닥 챔버 상에 시딩하였다. 상부 챔버로부터 침윤된 PDX 세포는 공동 배양된 BM 면역세포에 반응하여 증가하였다(도 5). 흥미롭게도, BM 세포와 함께 바닥 챔버 내의 2% 혈청의 존재는 PDX 침윤에 필수적이었다.
그림 1: 세포 침윤 모니터링 및 세포 수집 시스템의 워크플로우 . (A) 스트로마 세포는 중간 챔버에 장착되는 바닥 챔버에 추가되며, 이는 가용성 인자에 대해서만 투과성이 있는 세포 장벽 역할을 한다. (b) 임피던스 바이오센서가 있는 상부 챔버는 모니터링될 세포주를 수신한다. 실시간 침입은 셀 수집을 위한 사용자 정의 시점에 도달할 때까지 기록됩니다. (C) 해체 된 상부 챔버는 반전되고, 세포는 셀 리프터를 사용하여 수확된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 어레이 챔버 및 수정 이미지. (A) 어레이를 빌드하는 데 사용된 세 개의 챔버. 전극을 수용하는 상부 챔버에서는 어떠한 수정도 이루어지지 않았다. (b) 중간 챔버 웰로부터, 2mm의 높이가 면도되고 개방 된 바닥에 부착 된 멤브레인; 세로 슬릿 (1.5 mm x 5.6 mm)을 양쪽에 첨가하였다. (c) 16-웰 설계를 복제하기 위해 제작된 하부 챔버(72mm x 18mm); 웰은 깊이 4.8mm, 직경 4.75mm, 삼각형 능선(가로 1.5mm x 세로 1.4mm)이 측면을 따라 추가되어 중간 챔버 슬릿으로 클릭됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 공동 배양된 섬유아세포가 암세포 침윤에 미치는 영향. (A) MDA-MB-231 세포 침윤, 단독 또는 3T3-J2 섬유아세포와 공동 배양(바닥 챔버)의 실시간 세포 분석. 3T3-J2 섬유아세포를 웰 당 30,000 또는 60,000 세포에 시딩하였다. (b) DCIS-Δ4 세포 침윤의 실시간 세포 분석, 단독 또는 3T3-J2 섬유아세포와 공동 배양(바닥 챔버). 단색 원은 평균을 나타냅니다. 얇은 점선은 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 내피 세포 침윤에 대한 암세포의 효과. HUVEC 침윤의 실시간 세포 분석은, 단독으로, 침습성 MDA-MB-231 세포(바닥 챔버) 또는 비침습성 DCIS 세포(바닥 챔버)와 공동 배양한다. 단색 원은 평균을 나타냅니다. 얇은 점선은 표준 편차를 나타냅니다. 시간 = 1h의 임피던스로 정규화된 델타 셀 인덱스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 골수 면역 세포와 공동 배양된 환자 유래 이종이식편(PDX)의 세포 침윤. PDX(상부 챔버)로부터 붕해된 단일 세포를 인간 골수 세포(하부 챔버)와 공동 배양하고, 혈청의 존재 또는 부재 하에 시간에 걸쳐 이들의 침윤을 모니터링하였다. 단색 원은 평균을 나타냅니다. 얇은 점선은 표준 편차를 나타냅니다. 시간 = 1시간 및 36분에 임피던스로 정규화된 델타 셀 인덱스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 | 성분 | 집중력/비율 |
| MDA-MD-231 미디어 | 증권 시세 표시기 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | 10% | |
| J2 섬유아세포 배지 | 증권 시세 표시기 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | 10% | |
| DCIS 미디어 | DMEM F12 | |
| 말 세럼 (HS) | 5% | |
| 표피 성장 인자 (EGF) | 20 ng/mL | |
| 인슐린 | 10 μg/mL | |
| 하이드로코르티손 | 0.5 μg/mL | |
| 콜레라 독소 | 100 ng/mL | |
| PDX 미디어 | DMEM F12 | |
| 태아 소 혈청 (FBS) | 2% | |
| 헤페스 | 1 엠 | |
| 인슐린 트랜스페린 셀레늄 에탄올아민 (ITS) | 10 μg/mL | |
| 하이드로코르티손 | 0.5 μg/mL | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 1 밀리그램/mL |
표 1: 세포 배양 배지 조성물. 표는 MDA-MD-231 배지, J2 섬유아세포 배지, DCIS 배지 및 PDX 배지의 조성을 열거한다.
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Discussion
우리는 기질 세포의 존재하에 실시간으로 세포 침윤을 모니터링하기위한 세 번째 챔버를 포함하도록 이중 챔버 어레이의 설계를 수정했습니다. 우리는 침습성 및 비침습적 암 세포에 대한 공동 배양된 섬유아세포의 뚜렷한 효과를 관찰하였는데, 이는 어레이가 공동 배양된 기질 세포에 의해 생성된 인자에 다르게 반응하는 암 세포 하위집단을 구별하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이 어레이는 또한 내피 세포가 기질 조직으로 침윤하는 것을 모니터링하는 데 사용되었는데, 이는 혈관이 다양한 침습 잠재력의 암세포가있는 상태에서 혈관 신생 자극을 향해 싹을 틔우는 중요한 단계입니다. 이들 실험은 암 세포 또는 다른 세포 단리를 위한 어레이의 다목적 사용을 보여준다.
각 챔버에 추가할 셀 수를 최적화하는 것이 좋습니다. 우리의 경험과 제조업체의 권장 사항에서 30,000-50,000 개의 세포가 최적입니다. 두 가지 세포 유형이 이 어레이에서 공동 배양될 수 있기 때문에, 그 중 하나는 스트로마 세포의 일차 배양일 수 있고, 생존력을 유지하기 위해 사용되는 세포에 대한 상이한 배지의 효과를 모니터링하는 것이 제안된다. 우리는 모니터링 할 세포의 굶주림이 반복실험 사이의 변화를 감소시킨다는 것을 발견했습니다. 무혈청 성장 조건이 세포에 해롭다면, 낮은 혈청과 더 짧은 기아 시간을 사용할 수 있습니다. 낮은 혈청 양 (1 % -2 %)의 첨가는 바닥 챔버에서 기질 세포 (1 차 세포)의 생존에 중요 할 수 있지만, 데이터 해석을위한 적절한 조절 조건 (즉, 기질 세포가 있거나없는 2 % 혈청)을 포함해야합니다. 침윤률이 낮으면 실험 조건 당 더 많은 웰이 하류 분석을 위해 수집 된 생존 가능한 세포의 수를 증가시킬 수 있습니다. 환자 생검을 분석 할 때, 세포 분석기 플레이트에서 테스트하기 전에 조직을 단일 세포로 분해하는 것이 중요합니다. 세포 생존율을 유지하기 위해 붕해 조건을 최적화하는 것은 침윤 분석을 수행하기 전에 중요한 단계이다. 또한 약물 치료에 대한 민감성 또는 침윤율에 대한 세포외 기저 매트릭스 (ECM) 성분의 효과와 같은 침윤의 추가 측면을 연구 할 수도 있습니다. ECM은 미세환경의 필수 성분이며, 세포 침윤 동안 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(13). 몇몇 발표된 연구들은 다양한 ECM 성분들(14,15)과의 상호작용을 모니터링하기 위해 침습성 세포가 추가되기 전에 ECM을 상부 챔버를 코팅하기 위해 ECM을 사용하였다. 세 개의 챔버 어레이는 침습성 세포와 스트로마 세포 사이의 공동 배양 상호작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 제안된 설계는 기질 세포 없이 침습성 세포에 특이적인 세포 수집을 보장하지만, 세포 간의 교차 대화가 상이한 세포 유형의 물리적 상호작용을 필요로 하는 경우 이 설정은 최적이 아닐 수 있다. 추가적으로, 현탁액에서 성장하는 비부착성 세포는 여기에 제안된 방법에서 수집되지 않을 수 있고(scrapping), 아직 비부착성 세포를 함유하는 분해된 챔버 내의 배지가 비부착성 세포를 수확하기 위해 수집될 수 있는 다른 접근법이다.
이 어레이는 기질 성분의 존재하에 세포 침윤을 모니터링하는 연구의 여러 영역에 활용 될 수 있지만, 여기서 우리는 암 세포 침윤과 이러한 접근법이 이종 생물학적 샘플에 존재하는 악성 암 세포 하위 집단을 발견 할 수있는 방법에 중점을 두었습니다. 여기에 사용된 삼-챔버형 어레이의 새로운 용량은 점점 더 덜 침습적인 암 세포를 포함하는 이종 암 세포 혼합물로부터 침습적 하위집단을 분리하기 위한 기능적 검정을 제공한다. 침습적 및 결과-관련 암 세포 하위집단의 분석은 혼합 세포 집단의 분석에 의해 획득되거나 편향되지 않는 적절한 기계론적 연구 및 분자 통찰력에 필수적이다. 기질 세포를 위한 공동-배양 챔버는 침습성 질환으로 진행하는 동안 종양 미세환경에서의 세포-세포 교차대화에 대한 통찰을 제공한다.
조직 샘플, 예를 들어, 환자로부터의 종양 생검에 적용하기 위한 단계로서, 우리는 환자 유래 종양 이종이식편(PDXs)으로부터 분리된 암 세포를 사용하고, 종양 세포의 침윤에 대한 인간 골수 세포의 영향을 시험하였다. 우리는 하류 분석을 위해 PDXs에 존재하는 침습성 세포, 즉 RNA-seq를 수집할 수 있었다. PDXs를 분석하는 것은 환자로부터 얻은 종양 생검에서 암 세포의 이종 혼합에 존재하는 세포 하위집단을 분석하기 위한 초기 단계이다. 궁극적 인 목표는 그러한 종양 생검을 사용하고 침범하는 암세포의 하위 집단을 분리하여 전이성 확산의 가능성으로 인해 나쁜 결과를 초래하는 것입니다. 분자 특징의 확인 및 약물 치료에 대한 이러한 침습적 하위집단의 민감도를 시험하는 것은 향후 응용될 것이다.
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Disclosures
조지 타운 대학은이 원고에 설명 된 접근법 중 일부와 관련된 특허를 출원했습니다. G.M.S, A.W, L.D 및 M.P는 이 출원에서 발명가로 명명되고 잠재적인 이해 상충으로 선언된다.
Acknowledgments
유타 대학교 헌츠만 암 연구소의 알라나 웰름스 박사에게 환자 유래 이종이식편(HCI-010)을 제공해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01CA205632, R21CA226542 및 부분적으로 애질런트 테크놀로지스의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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