Summary
Vi beskriver ett tillvägagångssätt för att upptäcka och fånga invasiva cellsubpopulationer i realtid. Den experimentella designen använder real-time cellular analysis genom att övervaka förändringar i cellernas elektriska impedans. Invasiv cancer, immun-, endotel- eller stromaceller i komplexa vävnader kan fångas upp och effekterna av samkulturer kan bedömas.
Abstract
Invasion och metastatisk spridning av cancerceller är den främsta dödsorsaken från cancer. Analyser som utvecklades tidigt för att mäta den invasiva potentialen hos cancercellpopulationer genererar vanligtvis en enda slutpunktsmätning som inte skiljer mellan cancercellssubpopulationer med olika invasiv potential. Tumörmikromiljön består också av olika bosatta stroma- och immunceller som förändrar och deltar i cancercellernas invasiva beteende. Invasion i vävnader spelar också en roll i immuncellssubpopulationer som avvärjer mikroorganismer eller eliminerar sjuka celler från parenkym och endotelceller under vävnadsombyggnad och angiogenes. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) som använder impedansbiosensorer för att övervaka cellinvasion var ett stort steg framåt bortom slutpunktsmätning av invasion: detta ger kontinuerliga mätningar över tid och kan därmed avslöja skillnader i invasionshastigheter som går förlorade i slutpunktsanalysen. Med hjälp av nuvarande RTCA-teknik utvidgade vi dubbelkammarmatriser genom att lägga till ytterligare en kammare som kan innehålla stromala och / eller immunceller och gör det möjligt att mäta invasionshastigheten under påverkan av utsöndrade faktorer från samodlingade stromala eller immunceller över tiden. Utöver detta möjliggör den unika designen att lossa kamrar när som helst och isolera den mest invasiva cancercellen eller andra cellsubpopulationer som finns i heterogena blandningar av testade tumörisolat. Dessa mest invasiva cancerceller och andra cellsubpopulationer driver malign progression till metastatisk sjukdom, och deras molekylära egenskaper är viktiga för djupgående mekanistiska studier, utveckling av diagnostiska sonder för deras upptäckt och bedömning av sårbarheter. Således kan införandet av små eller stora molekylära läkemedel användas för att testa potentialen hos terapier som riktar sig mot cancer och / eller stromacellsubpopulationer med målet att hämma (t.ex. cancerceller) eller förbättra (t.ex. immunceller) invasivt beteende.
Introduction
Cellinvasion är en viktig process som gör det möjligt för celler att korsa basalmembranbarriärer som svar på miljösignaler som tillhandahålls av stromaceller. Det är ett avgörande steg under flera utvecklingsstadier för immunsvar, sårläkning, vävnadsreparation och maligniteter som kan utvecklas från lokala lesioner till invasiva och metastatiska cancerformer1. Analyser som utvecklades tidigt för att mäta den invasiva potentialen hos cellpopulationer genererar vanligtvis en enda slutpunktsmätning eller kräver förmärkning av invasiva celler2. Integrationen av mikroelektronik och mikrofluidiktekniker är nu utvecklad för att detektera olika aspekter av cellbiologi såsom livskraft, rörelse och fastsättning med hjälp av den elektriska impedansen hos levande celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmätning möjliggör en etikettfri, icke-invasiv och kvantitativ bedömning av cellstatus3. Här beskriver vi en trekammarmatris baserad på utformningen av Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systemet som utvecklades av Abassi et al.5. Den trekammare matrisen möjliggör bedömning av samodlingade celler på cellulär invasion och återhämtning av invasiva celler för ytterligare analyser eller expansion.
I cellanalysatorsystemet invaderar celler genom en extracellulär matris belagd på ett poröst membran och når en interdigiterad elektrodmatris placerad på motsatt sida av barriären. Eftersom de invasiva cellerna fortsätter att fästa och ockupera denna elektrodmatris över tiden förändras den elektriska impedansen parallellt. Det nuvarande systemet består av en cellinvasion och migration (CIM) 16-brunnsplatta med två kamrar. RTCA-DP-instrumentet (dual purpose) (kallat dual purpose cell analyzer hädanefter) innehåller sensorer för impedansmätning och integrerad programvara för att analysera och bearbeta impedansdata. Impedansvärden vid baslinjen beror på jonstyrkan hos media i brunnarna och ändras när celler fäster vid elektroderna. Impedansförändringarna beror på antalet celler, deras morfologi och i vilken utsträckning celler fäster vid elektroderna. En mätning av brunnarna med media innan cellerna tillsätts betraktas som bakgrundssignal. Bakgrunden subtraheras från impedansmätningar efter att ha nått jämvikt med celler som fäster och sprider sig på elektroderna. En enhetslös parameter för cellernas status på en elektrod benämnt Cell Index (CI) beräknas enligt följande: CI = (impedans efter jämviktsimpedans i frånvaro av celler) / nominellt impedansvärde6. När migrationshastigheter för olika cellinjer jämförs kan Delta CI användas för att jämföra cellstatus oavsett skillnaden i fastsättning som representeras i de första mätningarna.
Den nydesignade trekammarmatrisen bygger på den befintliga designen och använder toppkammaren från det dubbla cellanalysatorsystemet som innehåller elektroderna. De modifierade mellan- och bottenkamrarna är anpassade för att passa in i cellanalysatorn med dubbla syften för impedansmätning och analys med hjälp av den integrerade programvaran. De två stora framstegen som den nya designen ger över den befintliga CIM-plattan med dubbla kammare (kallad cellanalysatorplatta hädanefter) är: i) förmågan att återhämta sig och sedan analysera invasiva cellsubpopulationer som finns i heterogena cellblandningar och ii) möjligheten att bedöma effekterna av utsöndrade faktorer från samkulturerade stromala eller immunceller på cellinvasion (Figur 1).
Denna teknik kan vara användbar för att studera delpopulationerna av celler med olika invasiv kapacitet. Detta inbegriper (a) invasiva cancerceller som invaderar omgivande vävnader eller blod och lymfkärl eller extravaserar vid metastaserande såddplatser i avlägsna organ, (b) celler från immunsystemet som invaderar vävnader för att ta itu med patogener eller sjuka celler, (c) endotelceller som invaderar vävnader för att bilda nya blodkärl under vävnadsomorganisation eller sårläkning, samt (d) stromaceller från tumörmikromiljön som stöder och invaderar tillsammans med cancerceller. Tillvägagångssättet möjliggör inkludering av stromal cross-talk som kan modulera cellmotilitet och invasion. Genomförbarhetsstudierna som visas här använder denna modifierade matris fokuserad på cancercellinvasion och interaktionen med stroma som ett modellsystem, inklusive endotelinvasion som svar på differentiella signaler från cancerceller. Tillvägagångssättet kan extrapoleras för att isolera cancerceller och andra celltyper såsom subpopulationer av immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testade invasiva och icke-invasiva etablerade bröstcancercellinjer som ett principbevis. Vi använde också celler från patient-härledd xenograft (PDX) invasion som svar på immunceller från mänsklig benmärg för att visa genomförbarhet för framtida användning även i kliniska diagnostiska inställningar. PDX är patienttumörvävnader som implanteras i immunkompromitterade eller humaniserade mössmodeller för att möjliggöra studier av tillväxt, progression och behandlingsalternativ för den ursprungliga patienten 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien granskades och betraktades som "undantagen" av Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Nyskördade benmärgsvävnader samlades in från kasserade friska humana benmärgsuppsamlingsfilter som hade avidentifierats.
1. Ny kammardesign (figur 2)
- Öppna en ny cellanalysatorplatta med dubbla kammare. Lägg åt sidan den övre kammaren med elektroder.
- Raka av 2 mm av de U-formade bottenbrunnarna på cellanalysatorplattan med en fräsmaskin.
- Fäst ett 2 cm x 7 cm polyetersulfonmembran (PES) med 0,2 μm porstorlek på botten av de rakade brunnarna med UV-kurerat lim. Låt 30 min härdningstid för att säkerställa att limet är helt härdat och inert.
- Skär ut två längsgående slitsar (1,5 mm x 5,6 mm) längs sidorna med hjälp av en fräsmaskin för att snäppa in i åsarna i den nytillverkade tredje kammaren.
- Använd en fräsmaskin och skapa en tredje polykarbonatkammare som replikerar de övergripande dimensionerna på cellanalysatorplattan; 72 mm x 18 mm (Materialtabell).
- Skapa brunnar 4,8 mm djupa och 4,75 mm i diameter för att replikera cellanalysatorplattans 16-brunnsdesign. Detta möjliggör 90 μL volym per brunn.
- På sidorna skapar du två triangulära åsar så att kammaren låses in i de ursprungliga slitsarna som skapades i steg 1.4. Den horisontella delen av triangeln är 1,5 mm, vertikalen är 1,4 mm och hypotenusen är 2,052 mm.
- Skapa en ratt på kortsidan som är 50,8 mm i diameter och 1,397 mm i höjd för att passa in i originalplattans hack (Figur 2, Mitten).
- Använd en 0,9 mm tjock gummibricka för varje brunn för att ge en förseglad passform.
2. Cellodling (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblaster)
- Tvätta vidhäftande cellkulturer (~ 70% sammanflöde) med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 0,05% trypsin-EDTA-lösning för att lyfta bort cellerna.
- Neutralisera trypsinlösningen med cellodlingsmedier innehållande serum och räkna cellerna med hjälp av en alikvot av cellsuspensionen.
OBS: Det specifika cellodlingsmediet finns i tabell 1.
3. Patient-härledd xenograft dissociation
- Hacka en ny tumörbit (1 cm2) i fin mush med en steril skalpell.
- Placera i ett 50 ml koniskt rör med 20 ml DMEM F12-media kompletterat med 3 mg / ml trypsin och 2 mg / ml kollagenas.
- Inkubera i en termisk shaker (150 RPM) vid 37 ° C i 20 min.
- Snurra röret vid 500 x g i 5 min; ta bort supernatanten.
- Tillsätt 20 μL DMEM F12 + 2% FBS för att tvätta cellerna; snurra på 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätten två gånger till.
- Resuspend i 1 ml PDX-media (tabell 1) för att räkna cellerna.
4. Extraktion av benmärgsceller
- Spola benmärgens (BM) uppsamlingsfilter med 25 ml 1x PBS.
OBS: I denna studie tillsattes PBS till ett använt BM-insamlingsfilter från sjukhuset för att samla in resterande BM i filtret. - Tillsätt den spolade BM långsamt till ett 50 ml koniskt rör med 25 ml densitetsgradientmedium, var noga med att hålla skikten så separata som möjligt.
- Snurra vid 800 x g i 20 min vid 18 °C
- Sippra av de övre skikten efter centrifugering (fett / plasma) och överför 5 ml av det vita skiktet ovanför densitetsgradientmediet som har BM-cellerna till ett 15 ml koniskt rör.
OBS: Alternativt doppa en 5 ml pipett i det övre lagret tills den vidrör mellanskiktet (BM) och pipettera ut mellanskiktet mycket långsamt utan att flytta pipetten. - Fyll det 15 ml koniska röret med 1x PBS (~ 10 ml) och snurra vid 300 x g i 15 min.
- Ta bort supernatanten; den återstående vita pelleten är BM.
- Om röda blodkroppar observeras i pelleten, tillsätt 5 ml RBC-lyslösning (materialtabell) och låt den sitta i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Snurra på 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Tillsätt 10 ml 1x PBS för att tvätta cellerna, snurra vid 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten. Upprepa RBC-lysen (steg 4.7) tills pelletsen är vit.
5. Cellsådd och montering
- Placera alla tre sterila kamrarna i vävnadsodlingshuven.
- Leta reda på ratten på kortsidan av den nedre kammaren. Orientera den nedre kammaren så att vredet är vänt mot experimenteraren.
- Tillsätt 30 000-50 000 celler i 90 μL media till varje brunn i den nedre kammaren. Undvik att bilda bubblor. Dessa är stromacellerna som kommer att ge utsöndrade faktorer men kommer inte att detekteras av elektroderna i toppkammaren.
- Använd 5% fetalt serum-kompletterat medium från nötkreatur i två nedre kammarbrunnar som en positiv kontroll för cellmotilitet. Använd 0% serum-kompletterat medium som en negativ kontroll.
- Låt den nedre kammaren med cellerna sitta i 10-15 min i huven för att sätta sig.
OBS: Detta steg rekommenderas om cellerna är vidhäftande eller växer i suspension. - Vrid den nedre kammaren vid 90 ° och placera mittkammaren ovanpå så att ratten på den nedre kammaren glider in i skåran på mittkammaren.
OBS: Vredet på den nedre kammaren och den blå pricken på mittkammaren är i motsatta ändar av enheten. - Tryck vertikalt nedåt tills ett klickljud hörs från var och en av enhetens långsidor.
- Tillsätt 160 μL serumfritt medium till alla brunnar i mittkammaren.
- Se till att en kupolformad menisk är synlig efter att brunnarna är fyllda; annars justerar du den slutliga volymen baserat på pipettkalibreringen. Undvik att bilda bubblor.
- Placera den övre kammaren med elektroder vända ner på mittkammaren och se till att rikta in de blå prickarna på mitten och övre kamrarna.
- Tryck vertikalt nedåt tills ett klickljud hörs från var och en av enhetens långsidor.
- Tillsätt 25-50 μL serumfritt medium till den övre kammaren.
- Montera enheten på cellanalysatorn med dubbla syften i vävnadsodlingsinkubatorn och vänta i 30 minuter innan du mäter bakgrunden.
OBS: Denna tid är nödvändig för att balansera matrisen och kan användas för att förbereda cellinjerna som ska läggas till i den övre kammaren. - Mät bakgrunden (se avsnitt 6) och sätt tillbaka aggregatet i vävnadsodlingshuven.
- Tillsätt 30 000-50 000 celler i 100 μL serumfritt medium till varje brunn i den övre kammaren. Dessa är de celler som elektroden kommer att upptäcka när de framgångsrikt migrerar genom membranet.
OBS: För att uppnå maximal respons rekommenderas att odla celler i serumfritt eller lågt serummedium i 6-18 timmar innan analysen utförs. - Låt aggregatet stå i huven i 30 minuter innan du monterar på cellanalysatorn med dubbla syften för impedansmätning.
6. Bakgrunds- och impedansmätning
- Placera matrisen i vaggan i instrumentet för cellanalysator med dubbla syften.
- Öppna cellanalysatorprogramvaran och välj den vagga som ska användas.
- Klicka på fliken Meddelande och se till att det står Anslutningar OK för att säkerställa att matrisen är väl placerad i vaggan och elektroderna är väl anpassade till sensorerna.
- Klicka på fliken Experimentanteckningar och fyll i så mycket information om experimentet som möjligt.
- Klicka på fliken Layout och fyll i beskrivningen av matrislayouten.
- Klicka på fliken Schema och lägg till två steg från menyn Steg ; ett bakgrundssteg (ett svep) och ett teststeg med 100 svep - ett svep var 15: e minut, totalt 25 timmar.
- När matrisen har varit i inkubatorn för cellanalysatorer med dubbla syften i 30 minuter klickar du på Play-knappen för att starta bakgrundsmätningen. Ett fönster som ber om att välja mappen för att spara data dyker upp.
- När bakgrundsmätningen är klar, ta bort matrisen från vaggan och placera den tillbaka i cellodlingshuven.
- Lägg till celler i den övre kammaren enligt beskrivningen i steg 5.13 och håll enheten i vävnadsodlingshuven i 30 minuter så att cellerna kan sätta sig.
- Placera matrisen tillbaka i cellanalysatorn med dubbla syften och kontrollera fliken Meddelande för meddelandet Anslutningar OK .
- Klicka på Play-knappen för att starta impedansmätningen.
- Klicka på fliken Plot för att övervaka signalens framsteg.
- Om slutpunkten nås före 25 timmar klickar du på steget Avbryt i listrutan Kör .
- Om du vill exportera data högerklickar du på diagrammet, väljer Kopiera i listformat och klistrar sedan in data i ett kalkylblad.
OBS: Data kan exporteras som cellindex eller deltacellindex. Diagram- och/eller layoutinformation kan också väljas för export.
7. Lossning och cellsamling
- Övervaka migrationshastigheten i realtid på cellanalysatorn med dubbla syften för att bestämma stopppunkten för intresse (6-18 timmar).
OBS: Stopppunkten beror på cellens invasionshastighet och när en distinkt invasionssignal från den negativa kontrollen uppnås. - När det har uppnåtts, demontera enheten från cellanalysatorn med dubbla syften och placera den i vävnadsodlingshuven.
- Förbered ett lämpligt antal 1,5 ml mikrocentrifugrör för att samla cellerna från brunnarna av intresse.
- Placera enheten i en 10 cm skål för att innehålla vätskor när kamrarna lossnar.
- Tryck de flexibla knäppändarna på långsidan av mittkammaren inåt tills ett klickljud hörs.
- Demontera toppkammaren och invertera den till en ny 10 cm skål.
- Använd en celllyftare med ett 13 mm blad för att samla cellerna från alla brunnar som har samma experimentella tillstånd (dvs. celltyp, läkemedelsbehandling etc.).
OBS: Utforma installationen så att den har minst två brunnar för varje experimentellt tillstånd för att uppnå statistiskt signifikant förändring från negativa kontroller. - Skölj eller doppa bladet i 1x fosfatbuffrad saltlösning för att samla cellerna i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Snurra ner cellerna vid 500 x g i 5 min.
- Föröka de insamlade cellerna (se avsnitt 8) eller utföra slutpunktsanalys såsom encelligt RNA-seq.
OBS: För bulk RNA-seq, använd ett RNA-extraktionssats med lågt cellnummer.
8.3D cellförökning och hämtning
OBS: På grund av det lilla antalet celler som samlas in, frö cellerna i 3D med hjälp av en extracellulär matris (ECM) för att förbättra livskraften. Som sagt, 2D-odling är också ett alternativ vid denna tidpunkt, särskilt om cellerna som används kommer från etablerade cellinjer.
- Tina en alikvot av basalmembranmatrisen vid 4 °C över natten. Håll basalmembranmatrisen på is tills den är klar att användas.
- Tillsätt 25 μL kall basalmembranmatris till pelletsen av levande celler som samlats in och pipettera försiktigt upp och ner för att blanda. Undvik att bilda bubblor.
- Tillsätt cell-basalmembranmatrisblandningen till botten av en liten vävnadsodlingsbrunn (dvs i en 96-brunnsplatta) och bilda en kupol. Försök att inte röra brunnens väggar. Inkubera vid 37 °C i 20 minuter innan du försiktigt tillsätter 100 μL media droppvis.
- För att hämta celler, aspirera mediet och tillsätt 100 μL dispas till varje brunn.
- Inkubera vid RT i 10 min, pipettera upp och ner ibland.
- Överför cellerna och den upplösta basalmembranmatrisen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml 1x PBS, snurra vid 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten. Upprepa tvätten en gång.
- Aspirera supernatanten. Dela cellerna i pelletsen eller utför slutpunktsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den nydesignade trekammarmatrisen testades invasion av cellerna i närvaro eller frånvaro av stromaceller såsom fibroblaster. MDA-MB-231-cellinvasionen förbättrades när bestrålade schweiziska 3T3-fibroblaster (J2-stam) såddes i bottenkammaren, vilket möjliggjorde utbyte av faktorer mellan de två cellinjerna. Intressant nog ökade MDA-MB-231-invasionen när 3T3-J2-celler fördubblades i antal (Figur 3A). Å andra sidan verkar invasionshastigheten för en invasiv klon av MCFDCIS-celler (DCIS-Δ4)9 hämmas av korspratet med 3T3-J2-celler (figur 3B). Dessa data visar den användbara tillämpningen av den trekammare matrisen för att mäta varierande effekter av stroma, i detta fall fibroblaster, på cellinvasion.
Därefter användes för att övervaka förändringen i endotelcellernas rörlighet och invasion som svar på signaler från antingen invasiva (MDA-MB-231)10,11 eller icke-invasiva (DCIS)12 cancerceller, humana navelvenendotelceller (HUVEC) som representerar endotelceller som kantar blodkärlens väggar. HUVEC var mer invasiva som svar på faktorer som utsöndrades av MDA-MB-231-celler, till skillnad från de som utsöndrades av DCIS-celler (Figur 4). Detta överensstämmer med invasiva tumörers förmåga att rekrytera endotelceller för blodkärlsbildning och senare spridning i cirkulationen.
Uppgifterna ovan visar cellanalysatorsystemets förmåga att övervaka olika invasionshastigheter av cellinjer; när invasionen börjar, fortskrider och platåer. Detta gör det möjligt för användaren att välja den intressanta tidpunkten, till exempel efter de första 2-3 h av invasionen, för att fånga pionjärcellerna som initierar invasion och skiljer sig från följarcellerna som invaderar därefter genom kollektiv invasion.
Medan ovanstående data visar ett solidt principbevis för användningen av den trekammare matrisen för att observera invasion i en samkulturmiljö, ville vi testa den potentiella användbarheten av denna matris i kliniska och diagnostiska inställningar. För detta övervakades invasionen av cellsuspensioner från patienthärledda xenotransplantat (PDX)8 samodlade med immunceller från humana benmärgsprover. Totala humana benmärgs immunceller (BM) såddes på bottenkammaren med eller utan serum. PDX-celler invasion från den övre kammaren ökade som svar på samodlingade BM-immunceller (Figur 5). Intressant nog var närvaron av 2% serum i bottenkammaren med BM-cellerna avgörande för PDX-invasion.
Figur 1: Arbetsflöde för cellinvasionsövervaknings- och celluppsamlingssystemet. (A) Stroma-celler läggs till i bottenkammaren som är monterad på en mittkammare, som fungerar som en cellbarriär som endast är permeabel för lösliga faktorer. (B) Den övre kammaren med impedansbiosensorer tar emot cellinjen som ska övervakas. Realtidsinvasion registreras tills en användardefinierad tidpunkt för cellinsamling har nåtts. (C) Den demonterade toppkammaren är inverterad och celler skördas med hjälp av en celllyftare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bilder av matriskamrarna och modifieringarna. (A) De tre kamrarna som används för att bygga matrisen. Ingen modifiering gjordes på den övre kammaren som innehöll elektroderna. (B) Från mittkammarens brunnar har en höjd av 2 mm rakats av och ett membran fästs på den öppna botten. längsgående slitsar (1,5 mm x 5,6 mm) tillsattes på varje sida. (C) Nedre kammare (72 mm x 18 mm) tillverkad för att efterlikna konstruktionen med 16 brunnar. brunnarna är 4,8 mm djupa och 4,75 mm i diameter, triangelryggar (1,5 mm horisontella x 1,4 mm vertikala) läggs till längs sidorna för att klicka in i mittkammarens slitsar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av samodlingade fibroblaster på cancercellsinvasion. (A) Realtidscellulär analys av MDA-MB-231-cellinvasion, ensam eller i samodling med 3T3-J2-fibroblaster (bottenkammare). 3T3-J2 fibroblaster såddes vid antingen 30 000 eller 60 000 celler per brunn. (B) Realtidscellulär analys av DCIS-Δ4-cellinvasion, ensam eller i samodling med 3T3-J2-fibroblaster (bottenkammare). De fasta cirklarna representerar medelvärdet; de tunna prickade linjerna representerar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekten av cancerceller på endotelcellsinvasion. Realtidscellulär analys av HUVEC-invasion, ensam, i samodling med de invasiva MDA-MB-231-cellerna (bottenkammaren) eller de icke-invasiva DCIS-cellerna (bottenkammaren). De fasta cirklarna representerar medelvärdet; de tunna prickade linjerna representerar standardavvikelsen. Deltacellindex normaliserat till impedansen vid tiden = 1 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Cellinvasion av patienthärledda xenotransplantat (PDX) samodlade med benmärgs immunceller. Enstaka celler sönderdelade från PDX (övre kammaren) samodlades med humana benmärgsceller (bottenkammare), och deras invasion övervakades över tid i närvaro eller frånvaro av serum. De fasta cirklarna representerar medelvärdet; de tunna prickade linjerna representerar standardavvikelsen. Deltacellindex normaliserat till impedansen vid tiden = 1 h och 36 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Media | Beståndsdelar | Koncentration/andel |
| MDA-MD-231-media | DMEM | |
| Serum från fetalt nötkreatur (FBS) | 10% | |
| J2 Fibroblaster media | DMEM | |
| Serum från fetalt nötkreatur (FBS) | 10% | |
| DCIS-media | DMEM F12 | |
| Hästserum (HS) | 5% | |
| Epidermal tillväxtfaktor (EGF) | 20 ng/ml | |
| Insulin | 10 μg/ml | |
| Hydrokortison | 0,5 μg/ml | |
| Koleratoxin | 100 ng/ml | |
| PDX-media | DMEM F12 | |
| Serum från fetalt nötkreatur (FBS) | 2% | |
| HEPES | 1 M | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITS) | 10 μg/ml | |
| Hydrokortison | 0,5 μg/ml | |
| Serumalbumin från nötkreatur (BSA) | 1 mg/ml |
Tabell 1: Cellodlingsmediets sammansättning. Tabellen visar kompositionerna av MDA-MD-231-media, J2 Fibroblasts-media, DCIS-media och PDX-media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har modifierat utformningen av en dubbelkammare för att inkludera en tredje kammare för övervakning av cellinvasion i realtid i närvaro av stromaceller. Vi har observerat tydliga effekter av samodlingade fibroblaster på invasiva och icke-invasiva cancerceller som indikerar att matrisen kan användas för att skilja mellan cancercellsubpopulationer som svarar annorlunda på faktorer som produceras av samkulturerade stromaceller. Arrayen användes också för att övervaka endotelcellsinvasion i stromala vävnader, ett kritiskt steg under blodkärl som groddar mot en angiogen stimulans i närvaro av cancerceller med varierande invasiv potential. Dessa experiment visar den mångsidiga användningen av matrisen för cancercell eller annan cellisolering.
Det rekommenderas att optimera antalet celler som ska läggas till varje kammare. Enligt vår erfarenhet och tillverkarens rekommendation är 30 000-50 000 celler optimala. Eftersom två celltyper kan samodlingas i denna matris, varav en kan vara en primär kultur av stromaceller, föreslås att övervaka effekterna av olika medier på celler som används för att upprätthålla livskraften. Vi fann att svält av celler som ska övervakas minskar variationen mellan replikat. Om serumfria tillväxtförhållanden är skadliga för cellerna kan lågt serum och kortare svälttider användas. Tillsatsen av en låg serummängd (1%-2%) kan vara avgörande för överlevnaden av stromaceller (primära celler) i den nedre kammaren, men se till att inkludera lämpliga kontrollförhållanden för datatolkning (dvs. 2% serum med och utan stromaceller). Om invasionsgraden är låg kan fler brunnar per experimentellt tillstånd öka antalet livskraftiga celler som samlas in för nedströms analyser. Vid analys av patientbiopsier är sönderdelningen av vävnad i enskilda celler avgörande innan testning på cellanalysatorplattan. Optimering av sönderdelningsförhållanden för att upprätthålla cellens livskraft är ett viktigt steg innan invasionsanalysen utförs. Det är också möjligt att studera ytterligare aspekter av invasion, såsom känslighet för läkemedelsbehandling eller effekten av extracellulära källarmatriskomponenter (ECM) på invasionshastigheten. ECM är en väsentlig del av mikromiljön och har rapporterats spela en viktig roll under cellinvasion13. Flera publicerade studier har använt ECM för att belägga den övre kammaren innan invasiva celler läggs till för att övervaka deras interaktion med olika ECM-komponenter 14,15. Den trekammare matrisen är ett användbart verktyg för att studera samodlingsinteraktioner mellan invasiva och stromaceller. Medan den föreslagna designen garanterar en cellsamling som är specifik för de invasiva cellerna utan stromaceller, kanske denna inställning inte är optimal om korspratet mellan celler kräver fysisk interaktion mellan de olika celltyperna. Dessutom kan icke-vidhäftande celler som växer i suspension inte samlas in i de föreslagna metoderna här (skrotning), men ett annat tillvägagångssätt där media i de demonterade kamrarna som innehåller de icke-vidhäftande cellerna kan samlas in för att skörda de icke-vidhäftande cellerna.
Medan denna matris kan användas för flera forskningsområden som övervakar cellinvasion i närvaro av en stromal komponent, fokuserade vi här på cancercellinvasion och hur detta tillvägagångssätt kan avslöja maligna cancercellsunderpopulationer som finns i heterogena biologiska prover. Den nya kapaciteten hos den trekammare matrisen som används här ger en funktionell analys för att isolera invasiva delpopulationer från heterogena cancercellblandningar som innehåller mer och mindre invasiva cancerceller. Analys av invasiva och resultatrelevanta cancercellssubpopulationer är avgörande för lämpliga mekanistiska studier och molekylära insikter som inte kan erhållas eller förspända genom analys av en blandad cellpopulation. Samodlingskammaren för stromaceller ger insikter i cell-cell cross-talk i tumörmikromiljön under progression till invasiv sjukdom.
Som ett steg mot applicering på vävnadsprover, t.ex. tumörbiopsier från patienter, använde vi cancerceller som isolerades från patienthärledda tumörxenografter (PDX) och testade effekten av mänskliga benmärgsceller på invasionen av tumörceller. Vi kunde samla in de invasiva cellerna som finns i PDX: erna för nedströms analys, dvs RNA-seq. Analys av PDX är det första steget mot att analysera cellsubpopulationer som finns i den heterogena blandningen av cancerceller i tumörbiopsier erhållna från patienter. Det slutliga målet kommer att vara att använda sådana tumörbiopsier och isolera subpopulationer av cancerceller som invaderar och därmed driver dåliga resultat på grund av deras potential för metastatisk spridning. Identifiering av de molekylära egenskaperna och testning av känsligheten hos dessa invasiva delpopulationer för läkemedelsbehandling är framtida tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Georgetown University lämnade in ett patent relaterat till några av de tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript. G.M.S, A.W, L.D och M.P namnges som uppfinnare i denna ansökan och förklarar det som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, för att förse oss med patienthärledda xenotransplantat (HCI-010). Detta arbete stöddes av NIH-anslag R01CA205632, R21CA226542, och delvis av ett bidrag från Agilent Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
