Summary
نحن نصف نهجا للكشف عن المجموعات الفرعية للخلايا الغازية والتقاطها في الوقت الفعلي. يستخدم التصميم التجريبي التحليل الخلوي في الوقت الفعلي من خلال مراقبة التغيرات في المعاوقة الكهربائية للخلايا. يمكن التقاط السرطان الغازي أو الخلايا المناعية أو البطانية أو اللحمية في الأنسجة المعقدة ، ويمكن تقييم تأثير الثقافات المشتركة.
Abstract
الغزو والانتشار النقيلي للخلايا السرطانية هي السبب الرئيسي للوفاة من السرطان. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا السرطانية قياسا واحدا لنقطة النهاية لا يميز بين المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية ذات الإمكانات الغازية المختلفة. أيضا ، تتكون البيئة الدقيقة للورم من خلايا لحمية ومناعية مقيمة مختلفة تتغير وتشارك في السلوك الغازي للخلايا السرطانية. يلعب غزو الأنسجة أيضا دورا في المجموعات الفرعية للخلايا المناعية التي تتصدى للكائنات الحية الدقيقة أو تقضي على الخلايا المريضة من الحمة والخلايا البطانية أثناء إعادة تشكيل الأنسجة وتكوين الأوعية. كان التحليل الخلوي في الوقت الفعلي (RTCA) الذي يستخدم أجهزة الاستشعار الحيوية للمعاوقة لمراقبة غزو الخلايا خطوة كبيرة إلى الأمام تتجاوز قياس نقطة النهاية للغزو: وهذا يوفر قياسات مستمرة بمرور الوقت وبالتالي يمكن أن يكشف عن الاختلافات في معدلات الغزو التي يتم فقدانها في فحص نقطة النهاية. باستخدام تقنية RTCA الحالية ، قمنا بتوسيع صفائف الحجرة المزدوجة عن طريق إضافة غرفة أخرى يمكن أن تحتوي على خلايا لحمية و / أو مناعية وتسمح بقياس معدل الغزو تحت تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة مع مرور الوقت. علاوة على ذلك ، يسمح التصميم الفريد بفصل الغرف في أي وقت وعزل الخلايا السرطانية الأكثر توغلا ، أو المجموعات الفرعية الأخرى من الخلايا الموجودة في مزيج غير متجانس من عزلات الورم التي تم اختبارها. هذه الخلايا السرطانية الأكثر توغلا وغيرها من المجموعات الفرعية للخلايا تدفع التقدم الخبيث إلى مرض النقيلي ، وخصائصها الجزيئية مهمة للدراسات الميكانيكية المتعمقة ، وتطوير تحقيقات تشخيصية للكشف عنها ، وتقييم نقاط الضعف. وبالتالي ، يمكن استخدام تضمين الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة أو الكبيرة لاختبار إمكانات العلاجات التي تستهدف السرطان و / أو المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية بهدف تثبيط (على سبيل المثال ، الخلايا السرطانية) أو تعزيز (على سبيل المثال ، الخلايا المناعية) السلوك الغازي.
Introduction
غزو الخلايا هو عملية مهمة تسمح للخلايا بعبور حواجز الغشاء السفلي استجابة للإشارات البيئية التي توفرها الخلايا اللحمية. إنها خطوة حاسمة خلال عدة مراحل من التطور للاستجابات المناعية ، والتئام الجروح ، وإصلاح الأنسجة ، والأورام الخبيثة التي يمكن أن تتطور من الآفات المحلية إلى السرطانات الغازية والنقيلية1. عادة ما تولد الفحوصات التي تم تطويرها في وقت مبكر لقياس الإمكانات الغازية لمجموعات الخلايا قياسا واحدا لنقطة النهاية أو تتطلب وضع علامات مسبقة على الخلايا الغازية2. تم الآن تطوير تكامل تقنيات الإلكترونيات الدقيقة والموائع الدقيقة للكشف عن الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية مثل الجدوى والحركة والتعلق باستخدام المعاوقة الكهربائية للخلايا الحية على الأقطاب الكهربائية الدقيقة 3,4. يسمح قياس المعاوقة بإجراء تقييم كمي خال من الملصقات وغير جراحي وكمي لحالة الخلية3. هنا نصف مصفوفة من ثلاث غرف تستند إلى تصميم نظام التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي (RTCA) الذي طوره Abassi et al.5. تسمح المجموعة المكونة من ثلاث غرف بتقييم الخلايا المستزرعة بشكل مشترك على الغزو الخلوي واستعادة الخلايا الغازية لإجراء تحليلات إضافية أو توسيع.
في نظام محلل الخلايا ، تغزو الخلايا من خلال مصفوفة خارج الخلية مغلفة بغشاء مسامي وتصل إلى مجموعة أقطاب كهربائية متداخلة الهوية موضوعة على الجانب الآخر من الحاجز. مع استمرار الخلايا الغازية في التعلق واحتلال مجموعة الأقطاب الكهربائية هذه بمرور الوقت ، تتغير المعاوقة الكهربائية بالتوازي. يتكون النظام الحالي من لوحة غزو وهجرة الخلايا (CIM) المكونة من 16 بئرا مع غرفتين. يحتوي جهاز RTCA-DP (الغرض المزدوج) (يسمى محلل الخلايا ثنائي الغرض من الآن فصاعدا) على أجهزة استشعار لقياس المعاوقة وبرامج متكاملة لتحليل ومعالجة بيانات المعاوقة. تعتمد قيم المقاومة عند خط الأساس على القوة الأيونية للوسائط في الآبار ويتم تغييرها عندما تلتصق الخلايا بالأقطاب الكهربائية. تعتمد تغيرات المعاوقة على عدد الخلايا ومورفولوجيتها ومدى ارتباط الخلايا بالأقطاب الكهربائية. يعتبر قياس الآبار باستخدام الوسائط قبل إضافة الخلايا بمثابة إشارة خلفية. يتم طرح الخلفية من قياسات المعاوقة بعد الوصول إلى التوازن مع الخلايا التي تعلق وتنتشر على الأقطاب الكهربائية. يتم حساب معلمة غير موحدة لحالة الخلايا على قطب كهربائي يسمى مؤشر الخلية (CI) على النحو التالي: CI = (المعاوقة بعد التوازن - المعاوقة في حالة عدم وجود خلايا) / قيمة المعاوقة الاسمية6. عند مقارنة معدلات ترحيل خطوط الخلايا المختلفة، يمكن استخدام Delta CI لمقارنة حالة الخلية بغض النظر عن الفرق في المرفق الذي يتم تمثيله في القياسات القليلة الأولى.
تعتمد المصفوفة ثلاثية الغرف المصممة حديثا على التصميم الحالي وتستخدم الغرفة العلوية من نظام محلل الخلايا ثنائي الغرض الذي يحتوي على الأقطاب الكهربائية. يتم تكييف الغرف الوسطى والسفلية المعدلة لتناسب التجميع في محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس وتحليل المعاوقة باستخدام البرنامج المتكامل. التقدمان الرئيسيان اللذان يوفرهما التصميم الجديد على لوحة CIM الحالية ثنائية الغرفة (تسمى لوحة محلل الخلايا من الآن فصاعدا) هما: i) القدرة على التعافي ، ثم تحليل المجموعات الفرعية للخلايا الغازية الموجودة في خلطات الخلايا غير المتجانسة و ii) خيار تقييم تأثير العوامل المفرزة من الخلايا اللحمية أو المناعية المستزرعة على غزو الخلايا (الشكل 1).
يمكن أن تكون هذه التكنولوجيا مفيدة في دراسة المجموعات الفرعية للخلايا ذات القدرات الغازية المختلفة. ويشمل ذلك (أ) الخلايا السرطانية الغازية التي تغزو الأنسجة المحيطة أو الأوعية الدموية واللمفاوية أو تتكاثر في مواقع البذر النقيلي في الأعضاء البعيدة، (ب) الخلايا من الجهاز المناعي التي تغزو الأنسجة لمعالجة مسببات الأمراض أو الخلايا المريضة، (ج) الخلايا البطانية التي تغزو الأنسجة لتشكيل أوعية دموية جديدة أثناء إعادة تنظيم الأنسجة أو التئام الجروح، وكذلك (د) الخلايا اللحمية من البيئة الدقيقة للورم التي تدعم وتغزو جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية. يسمح هذا النهج بإدراج الحديث المتبادل اللحمي الذي يمكن أن يعدل حركة الخلايا والغزو. تستخدم دراسات الجدوى الموضحة هنا هذه المجموعة المعدلة التي تركز على غزو الخلايا السرطانية والتفاعل مع السدى كنظام نموذجي ، بما في ذلك الغزو البطاني استجابة للإشارات التفاضلية من الخلايا السرطانية. يمكن استقراء هذا النهج لعزل الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى مثل المجموعات الفرعية للخلايا المناعية أو الخلايا الليفية أو الخلايا البطانية. اختبرنا خطوط خلايا سرطان الثدي الغازية وغير الغازية كدليل على المبدأ. كما استخدمنا خلايا من غزو xenograft (PDX) المشتق من المريض استجابة للخلايا المناعية من نخاع العظم البشري لإظهار جدوى للاستخدام المستقبلي أيضا في إعدادات التشخيص السريري. PDX هي أنسجة ورم المريض التي يتم زرعها في نموذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو البشرية للسماح بدراسة النمو والتقدم وخيارات العلاج للمريض الأصلي 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة الدراسة واعتبارها "معفاة" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة جورجتاون (IRB # 2002-022). تم جمع أنسجة نخاع العظم التي تم حصادها حديثا من مرشحات جمع نخاع العظم البشرية السليمة المهملة التي تم إلغاء تحديدها.
1. تصميم غرفة جديدة (الشكل 2)
- افتح لوحة جديدة لتحليل الخلايا ثنائية الغرفة. ضع الغرفة العلوية جانبا مع الأقطاب الكهربائية.
- باستخدام آلة طحن ، حلق 2 مم من الآبار السفلية على شكل حرف U للوحة محلل الخلايا.
- قم بتوصيل غشاء بولي إيثرسلفون (PES) مقاس 2 سم × 7 سم بحجم مسام 0.2 ميكرومتر بقاع الآبار المحلوقة باستخدام مادة لاصقة بالأشعة فوق البنفسجية. اسمح بوقت تنظيم لمدة 30 دقيقة لضمان شفاء الغراء تماما وخامله.
- باستخدام آلة طحن ، قم بقطع شقين طوليين (1.5 مم × 5.6 مم) على طول الجانبين للانجذاب إلى تلال الغرفة الثالثة المصنعة حديثا.
- باستخدام آلة طحن ، قم بإنشاء غرفة ثالثة من البولي كربونات تكرر الأبعاد الكلية للوحة محلل الخلية ؛ 72 مم × 18 مم (جدول المواد).
- إنشاء آبار بعمق 4.8 مم وقطر 4.75 مم لتكرار تصميم 16 بئرا للوحة محلل الخلايا. هذا يسمح ب 90 ميكرولتر من الحجم لكل بئر.
- على الجانبين ، قم بإنشاء اثنين من التلال المثلثة بحيث تقفل الغرفة في الشقوق الأصلية التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.4. الجزء الأفقي من المثلث هو 1.5 ملم ، والعمودي هو 1.4 ملم ، والوتر هو 2.052 ملم.
- قم بإنشاء مقبض على الجانب القصير يبلغ قطره 50.8 مم وارتفاعه 1.397 مم ليتناسب مع درجة اللوحة الأصلية (الشكل 2 ، الوسط).
- استخدم غسالة مطاطية بسماكة 0.9 مم لكل بئر لتوفير ملاءمة مختومة.
2. زراعة الخلايا (MDA-MB-231 ، DCIS ، DCIS-Δ4 ، J2-الخلايا الليفية)
- اغسل مزارع الخلايا الملتصقة (~ 70٪ التقاء) باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف محلول التريبسين-EDTA بنسبة 0.05٪ لرفع الخلايا.
- تحييد محلول التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا التي تحتوي على مصل وحساب الخلايا باستخدام أليكوت من تعليق الخلية.
ملاحظة: يمكن العثور على وسائط زراعة الخلايا المحددة في الجدول 1.
3. انفصال xenograft المستمدة من المريض
- تقطع قطعة ورم طازجة (1 سم2) إلى هريس ناعم باستخدام مشرط معقم.
- ضع في أنبوب مخروطي 50 مل مع 20 مل من وسائط DMEM F12 المكملة ب 3 ملغ / مل تريبسين و 2 ملغ / مل كولاجيناز.
- احتضان في شاكر حراري (150 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- قم بتدوير الأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ؛ إزالة supernatant.
- أضف 20 ميكرولتر من DMEM F12 + 2٪ FBS لغسل الخلايا ؛ تدور في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. كرر الغسل مرتين أخريين.
- أعد التعليق في 1 مل من وسائط PDX (الجدول 1) لحساب الخلايا.
4. استخراج خلايا نخاع العظم
- اغسل مرشح جمع نخاع العظم (BM) باستخدام 25 مل من 1x PBS.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تمت إضافة PBS إلى مرشح جمع BM المستخدم من المستشفى لجمع BM المتبقي في الفلتر. - أضف BM المتدفق ببطء إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 25 مل من وسط تدرج الكثافة ، مع الحرص على إبقاء الطبقات منفصلة قدر الإمكان.
- تدور عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 18 درجة مئوية
- اسحب الطبقات العليا بعد الطرد المركزي (الدهون / البلازما) وانقل 5 مل من الطبقة البيضاء فوق وسط تدرج الكثافة الذي يحتوي على خلايا BM إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
ملاحظة: بدلا من ذلك، اغمس ماصة سعة 5 مل في الطبقة العليا حتى تلامس الطبقة الوسطى (BM) وقم بإخراج الطبقة الوسطى ببطء شديد دون تحريك الماصة. - املأ الأنبوب المخروطي سعة 15 مل ب 1x PBS (~ 10 مل) وقم بالدوران عند 300 × g لمدة 15 دقيقة.
- إزالة supernatant. الكريات البيضاء المتبقية هي BM.
- إذا لوحظت خلايا الدم الحمراء في الكريات ، أضف 5 مل من محلول تحلل RBC (جدول المواد) واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تدور في 300 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
- أضف 10 مل من 1x PBS لغسل الخلايا ، وتدور عند 300 × g لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. كرر تحلل RBC (الخطوة 4.7) حتى تصبح الكريات بيضاء.
5. بذر الخلايا وتجميعها
- ضع جميع الغرف المعقمة الثلاث في غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.
- حدد موقع المقبض على الجانب القصير من الغرفة السفلية. قم بتوجيه الغرفة السفلية بحيث يواجه المقبض المجرب .
- أضف 30,000-50,000 خلية في 90 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر من الغرفة السفلية. تجنب تشكيل فقاعات. هذه هي الخلايا اللحمية التي ستوفر عوامل إفرازية ولكن لن يتم اكتشافها بواسطة أقطاب الغرفة العلوية.
- استخدم 5٪ من الوسائط المكملة بمصل البقر الجنيني في بئرين من الغرف السفلية كعنصر تحكم إيجابي في حركة الخلايا. استخدم 0٪ من الوسائط المكملة بالمصل كعنصر تحكم سلبي.
- دع الغرفة السفلية مع الخلايا تجلس لمدة 10-15 دقيقة في الغطاء لتستقر.
ملاحظة: يوصى بهذه الخطوة إذا كانت الخلايا ملتصقة أو تنمو في حالة تعليق. - قم بتدوير الغرفة السفلية عند 90 درجة وضع الغرفة الوسطى في الأعلى بحيث ينزلق المقبض الموجود في الغرفة السفلية إلى الشق الموجود في الغرفة الوسطى.
ملاحظة: يوجد المقبض الموجود في الغرفة السفلية والنقطة الزرقاء الموجودة في الغرفة الوسطى في طرفي التجميع المتقابلين. - ادفع عموديا لأسفل حتى يتم سماع صوت نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.
- أضف 160 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى جميع آبار الغرفة الوسطى.
- تأكد من أن الغضروف المفصلي على شكل قبة مرئي بعد ملء الآبار. خلاف ذلك ، اضبط الحجم النهائي بناء على معايرة الماصة. تجنب تشكيل فقاعات.
- ضع الغرفة العلوية مع أقطاب كهربائية متجهة لأسفل إلى الغرفة الوسطى مع التأكد من محاذاة النقاط الزرقاء على الحجرتين الوسطى والعليا.
- ادفع عموديا لأسفل حتى يتم سماع صوت نقرة من كل جانب من الجوانب الطويلة للتجميع.
- أضف 25-50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى الغرفة العلوية.
- قم بتركيب التجميع على محلل الخلايا ثنائي الغرض في حاضنة زراعة الأنسجة وانتظر لمدة 30 دقيقة قبل قياس الخلفية.
ملاحظة: هذه المرة ضرورية لموازنة الصفيف ويمكن استخدامها لإعداد خطوط الخلايا لإضافتها إلى الغرفة العلوية. - قم بقياس الخلفية (انظر القسم 6) ووضع التجميع مرة أخرى في غطاء محرك الأنسجة.
- أضف 30,000-50,000 خلية في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر من الغرفة العلوية. هذه هي الخلايا التي سيكتشفها القطب الكهربائي بمجرد أن تهاجر بنجاح عبر الغشاء.
ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من الاستجابة، يوصى بزراعة الخلايا في وسائط مصل خالية أو منخفضة من المصل لمدة 6-18 ساعة قبل إجراء الفحص. - دع التجميع يقف في غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة قبل تركيبه على محلل الخلايا ثنائي الغرض لقياس المعاوقة.
6. قياس الخلفية والمعاوقة
- ضع الصفيف في المهد في أداة تحليل الخلايا ثنائية الغرض.
- افتح برنامج محلل الخلايا وحدد المهد المراد استخدامه.
- انقر فوق علامة التبويب رسالة وتأكد من أنها تقول اتصالات موافق لضمان وضع الصفيف بشكل جيد في المهد وأن الأقطاب الكهربائية محاذاة بشكل جيد مع أجهزة الاستشعار.
- انقر على علامة التبويب ملاحظات التجربة واملأ أكبر قدر ممكن من المعلومات حول التجربة .
- انقر فوق علامة التبويب تخطيط واملأ وصف تخطيط الصفيف.
- انقر فوق علامة التبويب جدولة وأضف خطوتين من قائمة الخطوات ؛ خطوة خلفية (عملية مسح واحدة) وخطوة اختبار مع 100 عملية مسح - عملية مسح كل 15 دقيقة ، يبلغ مجموعها 25 ساعة.
- بعد أن تكون المصفوفة في حاضنة تحليل الخلايا ثنائية الغرض لمدة 30 دقيقة ، انقر فوق الزر " تشغيل" لبدء قياس الخلفية. ستظهر نافذة تطلب اختيار المجلد لحفظ البيانات.
- بعد الانتهاء من قياس الخلفية ، قم بإزالة الصفيف من المهد وضعه مرة أخرى في غطاء مزرعة الخلية.
- أضف الخلايا إلى الغرفة العلوية كما هو موضح في الخطوة 5.13 ، واحتفظ بالتجميع في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة حتى تستقر الخلايا.
- ضع الصفيف مرة أخرى في محلل الخلايا ثنائي الغرض وتحقق من علامة التبويب رسالة " موافق على الاتصالات ".
- انقر فوق الزر " تشغيل" لبدء قياس المعاوقة.
- انقر فوق علامة التبويب رسم لمراقبة تقدم الإشارة.
- إذا تم الوصول إلى نقطة النهاية قبل 25 ساعة ، فانقر فوق خطوة إجهاض من القائمة المنسدلة تنفيذ .
- لتصدير البيانات، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الرسم البياني، واختر نسخ بتنسيق القائمة، ثم الصق البيانات في جدول بيانات.
ملاحظة: يمكن تصدير البيانات كفهرس خلية أو فهرس خلية دلتا. يمكن أيضا اختيار معلومات الرسم البياني و / أو التخطيط للتصدير.
7. مفرزة وجمع الخلايا
- راقب معدل الترحيل في الوقت الفعلي على محلل الخلايا ثنائي الغرض لتحديد نقطة التوقف المثيرة للاهتمام (6-18 ساعة).
ملاحظة: تعتمد نقطة التوقف على معدل غزو الخلية ومتى يتم تحقيق إشارة غزو مميزة من التحكم السلبي. - بمجرد تحقيقه ، قم بفك التجميع من محلل الخلايا ثنائي الغرض وضعه في غطاء زراعة الأنسجة.
- قم بإعداد عدد مناسب من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لجمع الخلايا من الآبار ذات الاهتمام.
- ضع التجميع في طبق 10 سم لاحتواء السوائل عند انفصال الغرف.
- ادفع نهايات الانجذاب المرنة على الجانب الطويل من الغرفة الوسطى إلى الداخل حتى يتم سماع صوت نقرة.
- قم بتفكيك الغرفة العلوية وقلبها إلى طبق جديد بحجم 10 سم.
- استخدم رافع الخلايا بشفرة 13 مم لجمع الخلايا من جميع الآبار التي تؤوي نفس الحالة التجريبية (أي نوع الخلية ، والعلاج الدوائي ، وما إلى ذلك).
ملاحظة: صمم الإعداد بحيث يحتوي على بئرين على الأقل لكل حالة تجريبية لتحقيق تغيير ذي دلالة إحصائية من عناصر التحكم السلبية. - شطف أو غمس الشفرة في 1x الفوسفات المخزن ملحيا مؤقتا لجمع الخلايا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
- قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
- نشر الخلايا التي تم جمعها (انظر القسم 8) أو إجراء تحليل نقطة النهاية مثل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
ملاحظة: بالنسبة للحمض النووي الريبي السائب، استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي ذات عدد الخلايا المنخفض.
8.3D انتشار الخلايا واسترجاعها
ملاحظة: نظرا لقلة عدد الخلايا التي تم جمعها ، قم بزرع الخلايا في 3D باستخدام مصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز قابلية البقاء. ومع ذلك ، فإن ثقافة 2D هي أيضا خيار في هذه المرحلة ، خاصة إذا كانت الخلايا المستخدمة من خطوط الخلايا الثابتة.
- قم بإذابة أليكوت من مصفوفة الغشاء السفلي عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. احتفظ بمصفوفة الغشاء السفلي على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
- أضف 25 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي البارد إلى حبيبات الخلايا الحية التي تم جمعها وماصة بلطف لأعلى ولأسفل للخلط. تجنب تشكيل فقاعات.
- أضف مزيج مصفوفة الغشاء الخلوي السفلي إلى قاع بئر زراعة الأنسجة الصغيرة (أي في صفيحة 96 بئرا) ، مما يشكل قبة. حاول ألا تلمس جدران البئر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل إضافة 100 ميكرولتر من الوسائط بلطف عن بعد.
- لاسترداد الخلايا ، قم بشفط الوسائط وإضافة 100 ميكرولتر من dispase إلى كل بئر.
- احتضان في RT لمدة 10 دقائق، وسحب لأعلى ولأسفل من حين لآخر.
- انقل الخلايا ومصفوفة الغشاء السفلي المذاب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل. أضف 1 مل من 1x PBS ، وتدور عند 300 × g لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. كرر الغسيل مرة واحدة.
- شفط السوبرناتانت. قم بتقسيم الخلايا في الكريات أو قم بإجراء تحليل نقطة النهاية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام المصفوفة ثلاثية الغرف المصممة حديثا ، تم اختبار غزو الخلايا في وجود أو عدم وجود خلايا لحمية مثل الخلايا الليفية. تم تعزيز غزو الخلايا MDA-MB-231 عندما تم زرع الخلايا الليفية السويسرية 3T3 المشععة (سلالة J2) في الغرفة السفلية ، مما يسمح بتبادل العوامل بين خطي الخلية. ومن المثير للاهتمام أن غزو MDA-MB-231 زاد عندما تضاعف عدد خلايا 3T3-J2 (الشكل 3A). من ناحية أخرى ، يبدو أن معدل غزو استنساخ غازي لخلايا MCFDCIS (DCIS-Δ4)9 مثبط من خلال الحديث المتبادل مع خلايا 3T3-J2 (الشكل 3B). تظهر هذه البيانات التطبيق المفيد للمصفوفة المكونة من ثلاث غرف لقياس التأثيرات المختلفة للسدى ، في هذه الحالة ، الخلايا الليفية ، على غزو الخلايا.
بعد ذلك ، لمراقبة التغيير في حركة الخلايا البطانية والغزو استجابة للإشارات من الخلايا السرطانية الغازية (MDA-MB-231) 10,11 أو غير الغازية (DCIS) 12 ، تم استخدام الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVECs) التي تمثل الخلايا البطانية المبطنة لجدران الأوعية الدموية. كانت HUVECs أكثر توغلا استجابة للعوامل التي تفرزها خلايا MDA-MB-231 ، على عكس تلك التي تفرزها خلايا DCIS (الشكل 4). وهذا يتفق مع قدرة الأورام الغازية على تجنيد الخلايا البطانية لتشكيل الأوعية الدموية ونشرها لاحقا في الدورة الدموية.
توضح البيانات المذكورة أعلاه قدرة نظام محلل الخلايا على مراقبة معدلات الغزو المختلفة لخطوط الخلايا. عندما يبدأ الغزو ، يتقدم والهضاب. هذا يسمح للمستخدم باختيار نقطة الاهتمام الزمنية ، على سبيل المثال ، بعد أول 2-3 ساعات من الغزو ، لالتقاط الخلايا الرائدة التي تبدأ الغزو وتختلف عن الخلايا التالية التي تغزو بعد ذلك عن طريق الغزو الجماعي.
في حين أن البيانات المذكورة أعلاه توضح دليلا قويا على المبدأ لاستخدام المصفوفة المكونة من ثلاث غرف لمراقبة الغزو في بيئة الثقافة المشتركة ، أردنا اختبار قابلية الاستخدام المحتملة لهذه المجموعة في الإعدادات السريرية والتشخيصية. لذلك ، تم رصد غزو معلقات الخلايا من xenografts المشتقة من المريض (PDX) 8 المستزرعة مع الخلايا المناعية من عينات نخاع العظم البشري. تم زرع الخلايا المناعية لنخاع العظم البشري الكلي (BM) في الغرفة السفلية مع أو بدون مصل. زاد غزو خلايا PDX من الغرفة العلوية استجابة للخلايا المناعية BM المستزرعة (الشكل 5). ومن المثير للاهتمام ، أن وجود مصل 2٪ في الغرفة السفلية مع خلايا BM كان ضروريا لغزو PDX.
الشكل 1: سير عمل نظام مراقبة غزو الخلايا وجمع الخلايا . (أ) تضاف خلايا السدى إلى الغرفة السفلية المثبتة على غرفة وسطى ، والتي تعمل كحاجز خلوي قابل للنفاذ للعوامل القابلة للذوبان فقط. (ب) تتلقى الغرفة العلوية المزودة بأجهزة استشعار حيوية مقاومة خط الخلية المراد مراقبته. يتم تسجيل الغزو في الوقت الفعلي حتى يتم الوصول إلى نقطة زمنية محددة من قبل المستخدم لجمع الخلايا. (ج) الغرفة العلوية المفككة مقلوبة ، ويتم حصاد الخلايا باستخدام رافع الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور غرف الصفيف والتعديلات . (أ) الغرف الثلاث المستخدمة لبناء الصفيف. لم يتم إجراء أي تعديل على الغرفة العلوية التي تؤوي الأقطاب الكهربائية. (ب) من آبار الغرفة الوسطى، حلق ارتفاع 2 مم وربط غشاء بالقاع المفتوح؛ تمت إضافة شقوق طولية (1.5 مم × 5.6 مم) إلى كل جانب. (ج) غرفة سفلية (72 مم × 18 مم) مصنعة لتكرار تصميم 16 بئرا؛ يبلغ عمق الآبار 4.8 مم ، وقطرها 4.75 مم ، وتضاف تلال المثلثات (1.5 مم أفقيا × 1.4 مم رأسيا) على طول الجانبين للنقر على شقوق الغرفة الوسطى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تأثير الخلايا الليفية المستزرعة بشكل مشترك على غزو الخلايا السرطانية. (أ) التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي لغزو خلايا MDA-MB-231 ، بمفرده أو في ثقافة مشتركة مع الخلايا الليفية 3T3-J2 (الغرفة السفلية). تم زرع الخلايا الليفية 3T3-J2 إما في 30000 أو 60000 خلية لكل بئر. (ب) التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي لغزو خلايا DCIS-Δ4 ، بمفرده أو في ثقافة مشتركة مع الخلايا الليفية 3T3-J2 (الغرفة السفلية). الدوائر الصلبة تمثل الوسط. تمثل الخطوط المنقطة الرقيقة الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأثير الخلايا السرطانية على غزو الخلايا البطانية. التحليل الخلوي في الوقت الحقيقي لغزو HUVEC ، وحده ، في الزراعة المشتركة مع خلايا MDA-MB-231 الغازية (الغرفة السفلية) أو خلايا DCIS غير الغازية (الغرفة السفلية). الدوائر الصلبة تمثل الوسط. تمثل الخطوط المنقطة الرقيقة الانحراف المعياري. تم تطبيع مؤشر خلايا دلتا مع المعاوقة في الوقت = 1 h. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: غزو الخلايا للزينوغرافتات المشتقة من المريض (PDX) المستزرعة بالاشتراك مع الخلايا المناعية لنخاع العظم. تم زراعة الخلايا المفردة المفككة من PDX (الغرفة العلوية) مع خلايا نخاع العظم البشرية (الغرفة السفلية) ، وتم رصد غزوها بمرور الوقت في وجود أو عدم وجود مصل. الدوائر الصلبة تمثل الوسط. تمثل الخطوط المنقطة الرقيقة الانحراف المعياري. تم تطبيع مؤشر خلايا دلتا مع المقاومة في الوقت = 1 ساعة و 36 دقيقة .
| وسائط | المكونات | التركيز/النسبة |
| وسائط MDA-MD-231 | DMEM | |
| مصل الجنين البقري (FBS) | 10% | |
| J2 الخلايا الليفية وسائل الإعلام | DMEM | |
| مصل الجنين البقري (FBS) | 10% | |
| وسائط DCIS | دميم F12 | |
| مصل الحصان (HS) | 5% | |
| عامل نمو البشرة (EGF) | 20 نانوغرام/مل | |
| إنسولين | 10 ميكروغرام/مل | |
| الهيدروكورتيزون | 0.5 ميكروغرام/مل | |
| سموم الكوليرا | 100 نانوغرام/مل | |
| وسائط PDX | دميم F12 | |
| مصل الجنين البقري (FBS) | 2% | |
| هيبس | 1 م | |
| الأنسولين ترانسفيررين السيلينيوم الإيثانولامين (ITS) | 10 ميكروغرام/مل | |
| الهيدروكورتيزون | 0.5 ميكروغرام/مل | |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | 1 ملغم/مل |
الجدول 1: تكوين وسائط زراعة الخلايا. يسرد الجدول تركيبات وسائط MDA-MD-231 ووسائط الخلايا الليفية J2 ووسائط DCIS ووسائط PDX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قمنا بتعديل تصميم مصفوفة مزدوجة الغرف لتشمل غرفة ثالثة لمراقبة غزو الخلايا في الوقت الفعلي في وجود خلايا لحمية. لقد لاحظنا تأثيرات متميزة للخلايا الليفية المستزرعة بشكل مشترك على الخلايا السرطانية الغازية وغير الغازية مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المصفوفة للتمييز بين المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية التي تستجيب بشكل مختلف للعوامل التي تنتجها الخلايا اللحمية المستزرعة بشكل مشترك. تم استخدام المصفوفة أيضا لمراقبة غزو الخلايا البطانية في الأنسجة اللحمية ، وهي خطوة حاسمة أثناء الأوعية الدموية التي تنبت نحو حافز وعائي المنشأ في وجود خلايا سرطانية ذات إمكانات غازية متفاوتة. تظهر هذه التجارب الاستخدام متعدد الاستخدامات للمصفوفة للخلايا السرطانية أو عزل الخلايا الأخرى.
يوصى بتحسين عدد الخلايا المراد إضافتها إلى كل غرفة. من تجربتنا وتوصية الشركة المصنعة ، 30000-50000 خلية هي الأمثل. نظرا لأنه يمكن زراعة نوعين من الخلايا بشكل مشترك في هذه الصفيف ، قد يكون أحدهما مزرعة أولية لخلايا السدى ، يقترح مراقبة تأثيرات الوسائط المختلفة على الخلايا المستخدمة للحفاظ على البقاء. وجدنا أن تجويع الخلايا المراد مراقبتها يقلل من التباين بين النسخ المتماثلة. إذا كانت ظروف النمو الخالية من المصل ضارة بالخلايا ، فيمكن استخدام المصل المنخفض وأوقات المجاعة الأقصر. قد تكون إضافة كمية منخفضة من المصل (1٪ -2٪) أمرا بالغ الأهمية لبقاء الخلايا اللحمية (الخلايا الأولية) في الغرفة السفلية ، ولكن تأكد من تضمين ظروف التحكم المناسبة لتفسير البيانات (أي 2٪ مصل مع وبدون خلايا لحمية). إذا كانت معدلات الغزو منخفضة ، فإن المزيد من الآبار لكل حالة تجريبية يمكن أن يزيد من عدد الخلايا القابلة للحياة التي تم جمعها للتحليلات النهائية. عند تحليل خزعات المرضى ، يعد تفكك الأنسجة إلى خلايا مفردة أمرا بالغ الأهمية قبل الاختبار على لوحة محلل الخلايا. يعد تحسين ظروف التفكك للحفاظ على بقاء الخلية خطوة مهمة قبل إجراء تحليل الغزو. ومن الممكن أيضا دراسة جوانب إضافية من الغزو، مثل الحساسية للعلاج من تعاطي المخدرات أو تأثير مكونات مصفوفة الطابق السفلي خارج الخلية (ECM) على معدل الغزو. تعد إدارة المحتوى المؤسسي مكونا أساسيا في البيئة الدقيقة وقد أفيد بأنها تلعب دورا رئيسيا أثناء غزو الخلايا13. استخدمت العديد من الدراسات المنشورة ECM لطلاء الغرفة العلوية قبل إضافة الخلايا الغازية لمراقبة تفاعلها مع مكونات ECM المختلفة14,15. تعد المجموعة المكونة من ثلاث غرف أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الزراعة المشتركة بين الخلايا الغازية والسدى. في حين أن التصميم المقترح يضمن مجموعة خلايا خاصة بالخلايا الغازية دون أي خلايا لحمية ، فقد لا يكون هذا الإعداد مثاليا إذا كان الحديث المتبادل بين الخلايا يتطلب التفاعل المادي لأنواع الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يتم جمع الخلايا غير الملتصقة التي تنمو في التعليق في الطرق المقترحة هنا (التخريد) ، ولكن يمكن من خلالها جمع الوسائط في الغرف المفككة التي تحتوي على الخلايا غير الملتصقة لحصاد الخلايا غير الملتصقة.
في حين يمكن استخدام هذه المجموعة في مجالات متعددة من الأبحاث التي تراقب غزو الخلايا في وجود مكون لحمية ، فقد ركزنا هنا على غزو الخلايا السرطانية وكيف يمكن لهذا النهج الكشف عن المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية الخبيثة الموجودة في عينات بيولوجية غير متجانسة. توفر السعة الجديدة للمصفوفة المكونة من ثلاث غرف المستخدمة هنا فحصا وظيفيا لعزل المجموعات الفرعية الغازية من مخاليط الخلايا السرطانية غير المتجانسة التي تحتوي على خلايا سرطانية أكثر وأقل توغلا. يعد تحليل المجموعات الفرعية للخلايا السرطانية الغازية وذات الصلة بالنتائج ضروريا للدراسات الميكانيكية المناسبة والرؤى الجزيئية التي لا يمكن الحصول عليها أو تحيزها من خلال تحليل مجموعة الخلايا المختلطة. توفر غرفة الزراعة المشتركة للخلايا اللحمية نظرة ثاقبة على الحديث المتبادل بين الخلايا والخلايا في البيئة الدقيقة للورم أثناء التقدم إلى مرض غازي.
كخطوة نحو التطبيق على عينات الأنسجة ، على سبيل المثال ، خزعات الورم من المرضى ، استخدمنا الخلايا السرطانية التي تم عزلها من xenografts الورم المشتق من المريض (PDXs) واختبرنا تأثير خلايا نخاع العظم البشري على غزو الخلايا السرطانية. تمكنا من جمع الخلايا الغازية الموجودة في PDXs لتحليلها في اتجاه مجرى النهر ، أي الحمض النووي الريبي. فحص PDXs هو الخطوة الأولية نحو تحليل المجموعات الفرعية للخلايا الموجودة في المزيج غير المتجانس من الخلايا السرطانية في خزعات الورم التي تم الحصول عليها من المرضى. سيكون الهدف النهائي هو استخدام خزعات الورم هذه وعزل المجموعات الفرعية من الخلايا السرطانية التي تغزو وبالتالي تؤدي إلى نتائج سيئة بسبب قدرتها على الانتشار النقيلي. تحديد السمات الجزيئية واختبار حساسية هذه المجموعات الفرعية الغازية للعلاج من تعاطي المخدرات هي تطبيقات مستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
قدمت جامعة جورجتاون براءة اختراع تتعلق ببعض الأساليب الموضحة في هذه المخطوطة. يتم تسمية G.M.S ، A.W ، L.D ، و M.P كمخترعين في هذا الطلب ويعلنون ذلك كتضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتورة ألانا ويلمز ، معهد هانتسمان للسرطان ، جامعة يوتا ، على تزويدنا ب xenografts المشتقة من المريض (HCI-010). تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01CA205632 و R21CA226542 ، وجزئيا ، بمنحة من Agilent Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
- Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
- Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
- Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 20050213374 1-88 (2013).
- Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
- Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
- Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
- Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).
