Summary
Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.
Abstract
Invasão e propagação metastática de células cancerígenas são a principal causa de morte por câncer. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações de células cancerosas normalmente geram uma única medição de ponto final que não distingue entre subpopulações de células cancerosas com diferentes potenciais invasivos. Além disso, o microambiente tumoral consiste em diferentes células estrômicas residentes e imunes que alteram e participam do comportamento invasivo das células cancerosas. A invasão aos tecidos também desempenha um papel nas subpopulações de células imunes que se defendem de microrganismos ou eliminam células doentes das células parenchyma e endotelial durante a remodelação tecidual e angiogênese. A Análise Celular em Tempo Real (RTCA) que utiliza biosensores de impedância para monitorar a invasão celular foi um grande passo em frente além da medição do ponto final da invasão: isso fornece medições contínuas ao longo do tempo e, portanto, pode revelar diferenças nas taxas de invasão que são perdidas no ensaio de ponto final. Usando a tecnologia RTCA atual, expandimos matrizes de câmara dupla adicionando uma câmara adicional que pode conter células estrômicas e/ou imunes e permite medir a taxa de invasão sob a influência de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas ao longo do tempo. Além disso, o design único permite desprender câmaras a qualquer momento e isolar a célula cancerígena mais invasiva, ou outras subpopulações celulares que estão presentes em misturas heterogêneas de isolados tumorais testados. Essas células cancerígenas mais invasivas e outras subpopulações celulares impulsionam a progressão maligna para doenças metastáticas, e suas características moleculares são importantes para estudos mecanicistas aprofundados, o desenvolvimento de sondas diagnósticas para sua detecção e a avaliação de vulnerabilidades. Assim, a inclusão de drogas de pequenas ou grandes moléculas pode ser usada para testar o potencial de terapias que visam o câncer e/ou subpopulações de células estromicas com o objetivo de inibir (por exemplo, células cancerosas) ou melhorar (por exemplo, células imunes) comportamento invasivo.
Introduction
A invasão celular é um processo importante que permite que as células cruzem barreiras de membrana de porão em resposta a pistas ambientais fornecidas por células estromas. É um passo crucial durante vários estágios de desenvolvimento para respostas imunes, cicatrização de feridas, reparação de tecidos e malignidades que podem progredir de lesões locais para cânceres invasivos e metastáticos1. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações celulares normalmente geram uma única medição de ponto final ou requerem pré-rotulagem de células invasoras2. A integração das técnicas de microeletrônica e microfluido é agora desenvolvida para detectar diferentes aspectos da biologia celular, como viabilidade, movimento e apego usando a impedância elétrica de células vivas em microeletrodos 3,4. A medição de impedância permite uma avaliação não invasiva e quantitativa do statuscelular 3. Aqui descrevemos uma matriz de três câmaras baseada no design do sistema RTCA (Real-Time Cellular Analysis, análise celular em tempo real) que foi desenvolvido pela Abassi et al.5. O conjunto de três câmaras permite a avaliação de células co-cultivadas sobre invasão celular e recuperação de células invasoras para análises adicionais ou expansão.
No sistema de analisador celular, as células invadem através de uma matriz extracelular revestida em uma membrana porosa e atingem uma matriz de eletrodos interdigitadas posicionada no lado oposto da barreira. À medida que as células invasoras continuam a prender e ocupar esta matriz de eletrodos ao longo do tempo, a impedância elétrica muda em paralelo. O sistema atual compreende uma placa de invasão e migração celular (CIM) de 16 poços com duas câmaras. O instrumento RTCA-DP (dual purpose cell analyzer a partir de agora) contém sensores para medição de impedância e software integrado para analisar e processar os dados de impedância. Os valores de impedância na linha de base dependem da força iônica da mídia nos poços e são alterados à medida que as células se ligam aos eletrodos. As mudanças de impedância dependem do número de células, sua morfologia, e até que ponto as células se ligam aos eletrodos. Uma medição dos poços com mídia antes que as células sejam adicionadas é considerada como o sinal de fundo. O fundo é subtraído de medidas de impedância depois de atingir o equilíbrio com células anexando e se espalhando para os eletrodos. Um parâmetro sem unidade do status das células em um índice celular denominado eletrodo (IC) é calculado da seguinte forma: IC = (impedância após equilíbrio - impedância na ausência de células) / valor de impedância nominal6. Quando as taxas de migração de diferentes linhas celulares são comparadas, o CI Delta pode ser usado para comparar o status da célula, independentemente da diferença de apego representada nas primeiras medições.
O recém-projetado array de três câmaras se baseia no design existente e usa a câmara superior do sistema de analisador de células de dupla finalidade que contém os eletrodos. As câmaras média e inferior modificadas são adaptadas para encaixar o conjunto no analisador de células de dupla finalidade para medição e análise de impedância usando o software integrado. Os dois principais avanços que o novo projeto proporciona sobre a placa CIM de duas câmaras existente (chamada placa analisador de células a partir de agora) são: i) a capacidade de recuperação e, em seguida, analisar subpopulações celulares invasivas que estão presentes em misturas de células heterogêneas e ii) a opção de avaliar o impacto de fatores secretados de células estromes ou imunes co-cultivadas na invasão celular (Figura 1).
Essa tecnologia pode ser útil no estudo das subpopulações de células com diferentes capacidades invasivas. Isso inclui (a) células cancerígenas invasivas que invadem tecidos ou sangue ao redor e vasos linfáticos ou extravasados em locais de semeadura metastática em órgãos distantes, (b) células do sistema imunológico que invadem tecidos para combater patógenos ou células doentes, (c) células endoteliais que invadem tecidos para formar novos vasos sanguíneos durante a reorganização tecidual ou cicatrização de feridas, assim como (d) células estromas do microambiente tumoral que suportam e invadem junto com células cancerígenas. A abordagem permite a inclusão de conversas cruzadas estromicas que podem modular a motilidade celular e a invasão. Os estudos de viabilidade aqui mostrados utilizam este conjunto modificado focado na invasão de células cancerosas e na interação com o estroma como um sistema modelo, incluindo a invasão endotelial em resposta a sinais diferenciais de células cancerosas. A abordagem pode ser extrapolada para isolar células cancerígenas e outros tipos de células, como subpopulações de células imunes, fibroblastos ou células endoteliais. Testamos linhas invasivas e não invasivas estabelecidas células cancerígenas de mama como prova de princípio. Também usamos células da invasão de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) em resposta às células imunes da medula óssea humana para mostrar viabilidade para uso futuro também em ambientes de diagnóstico clínico. PDX são tecidos tumorais do paciente que são implantados em camundongos imunocomprometidos ou humanizados para permitir o estudo do crescimento, progressão e opções de tratamento para o paciente original 7,8.
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Protocol
O estudo foi revisado e considerado como "isento" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Georgetown (IRB # 2002-022). Os tecidos de medula óssea recém-colhidos foram coletados a partir de filtros descartados de coleta de medula óssea humana saudável que haviam sido desidentificulados.
1. Novo desenho de câmara (Figura 2)
- Abra uma nova placa de analisador de células de câmara dupla. Reserve a câmara superior com eletrodos.
- Usando uma máquina de fresar, raspe 2 mm dos poços inferiores em forma de U da placa analisadora de células.
- Conecte uma membrana de 2 cm x 7 cm de poliethersulfone (PES) com tamanho de poros de 0,2 μm na parte inferior dos poços raspados usando adesivo com curadoria UV. Deixe 30 minutos de cura para garantir que a cola esteja completamente curada e inerte.
- Usando uma máquina de fresar, corte duas fendas longitudinais (1,5 mm x 5,6 mm) ao longo dos lados para encaixar nos cumes da terceira câmara recém-fabricada.
- Utilizando uma máquina de fresar, crie uma terceira câmara de policarbonato que replica as dimensões gerais da placa analisadora celular; 72 mm x 18 mm (Tabela de Materiais).
- Crie poços de 4,8 mm de profundidade e 4,75 mm de diâmetro para replicar o design de 16 poços da placa analisadora de células. Isso permite 90 μL de volume por poço.
- Nas laterais, crie dois cumes triangulares para que a câmara se bloqueie nas fendas originais criadas na etapa 1.4. A parte horizontal do triângulo é de 1,5 mm, a vertical é de 1,4 mm, e a hipotenusa é de 2.052 mm.
- Crie um botão no lado curto de 50,8 mm de diâmetro e 1.397 mm de altura para caber no entalhe da placa original (Figura 2, Médio).
- Use uma arruela de borracha de 0,9 mm de espessura para cada poço para fornecer um ajuste selado.
2. Cultura celular (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblasts)
- Lave culturas celulares aderentes (~70% de confluência) com soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS).
- Adicione 0,05% de solução trypsin-EDTA para levantar as células.
- Neutralizar a solução de trippsina com meios de cultura celular contendo soro e contar as células usando uma alíquota da suspensão celular.
NOTA: Os meios de cultura celular específicos podem ser encontrados na Tabela 1.
3. Dissociação de xenoenxerto derivada do paciente
- Pique uma peça de tumor fresca (1 cm2) em mingau fino usando um bisturi estéril.
- Coloque em um tubo cônico de 50 mL com 20 mL de mídia DMEM F12 complementada com trippsina de 3 mg/mL e colagenase de 2 mg/mL.
- Incubar em um agitador térmico (150 RPM) a 37 °C por 20 min.
- Gire o tubo a 500 x g por 5 min; remover o supernatante.
- Adicionar 20 μL de DMEM F12 + 2% FBS para lavar as células; gire a 300 x g por 5 min e remova o supernatante. Repita lavar mais duas vezes.
- Resuspend em 1 mL de mídia PDX (Tabela 1) para contar as células.
4. Extração de células de medula óssea
- Lave o filtro de coleta de medula óssea (BM) com 25 mL de 1x PBS.
NOTA: Neste estudo, a PBS foi adicionada a um filtro de coleta de BM usado do hospital para coletar o BM restante no filtro. - Adicione o BM lavado lentamente a um tubo cônico de 50 mL com 25 mL de gradiente de densidade, tomando cuidado para manter as camadas o mais separadas possível.
- Gire a 800 x g por 20 min a 18 °C
- Sifão das camadas superiores após centrifugação (gordura/plasma) e transfira 5 mL da camada branca acima do meio gradiente de densidade que tem as células BM para um tubo cônico de 15 mL.
NOTA: Alternativamente, mergulhe uma pipeta de 5 mL na camada superior até tocar a camada média (BM) e a pipeta para fora da camada média muito lentamente sem mover a pipeta. - Encha o tubo cônico de 15 mL com 1x PBS (~10 mL) e gire a 300 x g por 15 min.
- Remova o supernante; a pelota branca restante é a BM.
- Se os glóbulos vermelhos forem observados na pelota, adicione 5 mL de solução de lise RBC (Tabela de Materiais) e deixe-o sentado por 5 minutos à temperatura ambiente (RT). Gire a 300 x g por 5 min e remova o supernaspe.
- Adicione 10 mL de 1x PBS para lavar as células, gire a 300 x g por 5 min e remova o sobrenante. Repita a lise RBC (passo 4.7) até que a pelota esteja branca.
5. Semeadura e montagem de células
- Coloque as três câmaras estéreis na capa da cultura tecidual.
- Localize o botão no lado curto da câmara inferior. Oriente a câmara inferior para que o botão esteja voltado para o experimentador.
- Adicione 30.000-50.000 células em 90 μL de mídia a cada poço da câmara inferior. Evite formar bolhas. Estas são as células estromal que fornecerão fatores secretos, mas não serão detectadas pelos eletrodos da câmara superior.
- Use 5% de mídia bovina bovina-suplementada em dois poços de câmara inferior como um controle positivo para motilidade celular. Use 0% de mídia suplementada por soro como controle negativo.
- Deixe a câmara inferior com as células sentar por 10-15 minutos no capô para resolver.
NOTA: Esta etapa é recomendada se as células forem aderentes ou crescerem em suspensão. - Gire a câmara inferior a 90° e coloque a câmara do meio em cima para que o botão na câmara inferior deslize para o entalhe na câmara do meio.
NOTA: O botão na câmara inferior e o ponto azul na câmara do meio estão em extremidades opostas da montagem. - Empurre verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.
- Adicione 160 μL de mídia sem soro a todos os poços da câmara do meio.
- Certifique-se de que um menisco em forma de cúpula seja visível após o preenchimento dos poços; caso contrário, ajuste o volume final com base na calibração da pipeta. Evite formar bolhas.
- Coloque a câmara superior com eletrodos voltados para a câmara do meio, certificando-se de alinhar os pontos azuis nas câmaras média e superior.
- Empurre verticalmente para baixo até que um som de clique seja ouvido de cada um dos lados longos da montagem.
- Adicione 25-50 μL de mídia sem soro à câmara superior.
- Monte o conjunto no analisador de células de dupla finalidade na incubadora de cultura tecidual e espere por 30 minutos antes de medir o fundo.
NOTA: Este tempo é necessário para equilibrar a matriz e pode ser usado para preparar as linhas de celular a serem adicionadas à câmara superior. - Meça o fundo (ver seção 6) e coloque a montagem de volta na capa da cultura tecidual.
- Adicione 30.000-50.000 células em 100 μL de mídia sem soro a cada poço da câmara superior. Estas são as células que o eletrodo detectará assim que migrarem com sucesso através da membrana.
NOTA: Para obter a máxima resposta, recomenda-se cultivar células em mídia sérico livre de soro ou baixo por 6-18 h antes de realizar o ensaio. - Deixe a montagem ficar no capô por 30 minutos antes de montar no analisador de célula de dupla finalidade para medição de impedância.
6. Medição de fundo e impedância
- Coloque a matriz no berço no instrumento analisador de células de duplo propósito.
- Abra o software do analisador de células e selecione o berço a ser usado.
- Clique na guia Mensagem e certifique-se de que diz que as conexões OK para garantir que a matriz esteja bem colocada no berço e os eletrodos estejam bem alinhados com os sensores.
- Clique na guia Notas de experimento e preencha o máximo de informações sobre o experimento possível.
- Clique na guia Layout e preencha a descrição do layout do array.
- Clique na guia Agendar e adicione duas etapas do menu Passos ; um passo de fundo (uma varredura) e uma etapa de teste com 100 varreduras a cada 15 minutos, totalizando 25 h.
- Depois que a matriz estiver na incubadora de células de duplo propósito por 30 minutos, clique no botão Reproduzir para iniciar a medição de fundo. Uma janela pedindo para escolher a pasta para salvar os dados aparecerá.
- Depois que a medição de fundo for feita, remova a matriz do berço e coloque-a de volta na capa de cultura celular.
- Adicione células à câmara superior, conforme descrito na etapa 5.13, e mantenha a montagem na capa de cultura tecidual por 30 minutos para as células se instalarem.
- Coloque o array de volta no analisador de células de duplo propósito e verifique a guia Mensagem para a mensagem Conexões OK .
- Clique no botão Reproduzir para iniciar a medição de impedância.
- Clique na guia Plot para monitorar o progresso do sinal.
- Se o ponto final for atingido antes das 25h, clique na etapa abortar do menu suspenso execute .
- Para exportar dados, clique com o botão direito do mouse no gráfico, escolha Copiar no formato de lista e, em seguida, cole os dados em uma planilha.
NOTA: Os dados podem ser exportados como índice celular ou índice de célula delta. As informações de gráfico e/ou layout também podem ser escolhidas para exportação.
7. Desprendimento e coleta de células
- Monitore a taxa de migração em tempo real no analisador de células de dupla finalidade para determinar o ponto de parada de juros (6-18 h).
NOTA: O ponto de parada depende da taxa de invasão da célula e quando um sinal de invasão distinto do controle negativo é alcançado. - Uma vez alcançado, desmonte o conjunto do analisador celular de duplo propósito e coloque-o na capa da cultura tecidual.
- Prepare um número apropriado de tubos de microcentrifuuagem de 1,5 mL para coletar as células dos poços de interesse.
- Coloque o conjunto em um prato de 10 cm para conter líquidos quando as câmaras se soltarem.
- Empurre as extremidades flexíveis de estalo no lado longo da câmara do meio para dentro até que um som de clique seja ouvido.
- Desmonte a câmara superior e inverta-a em um novo prato de 10 cm.
- Use um levantador de células com uma lâmina de 13 mm para coletar as células de todos os poços que abrigam a mesma condição experimental (ou seja, tipo celular, tratamento medicamentoso, etc.).
NOTA: Projete a configuração para ter pelo menos dois poços para cada condição experimental para obter mudanças estatisticamente significativas de controles negativos. - Enxágüe ou mergulhe a lâmina em 1x salina tamponada de fosfato para coletar as células em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
- Gire as células a 500 x g por 5 min.
- Propague as células coletadas (ver seção 8) ou realize análises de ponto final, como RNA-seq unicelular.
NOTA: Para RNA-seq a granel, use um kit de extração de RNA de número de celular baixo.
8.3D propagação e recuperação celular
NOTA: Devido ao pequeno número de células coletadas, semeou as células em 3D usando uma matriz extracelular (ECM) para melhorar a viabilidade. Dito isto, a cultura 2D também é uma opção neste momento, especialmente se as células utilizadas são de linhas celulares estabelecidas.
- Descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão a 4 °C durante a noite. Mantenha a matriz de membrana do porão no gelo até estar pronto para usar.
- Adicione 25 μL de matriz de membrana fria do porão à pelota de células vivas coletadas e suavemente pipeta para cima e para baixo para misturar. Evite formar bolhas.
- Adicione a mistura de matriz de membrana célula-porão ao fundo de uma pequena cultura tecidual bem (ou seja, em uma placa de 96 poços), formando uma cúpula. Tente não tocar nas paredes do poço. Incubar a 37 °C por 20 min antes de adicionar suavemente 100 μL de mídia dropwise.
- Para recuperar células, aspire a mídia e adicione 100 μL de despase a cada poço.
- Incubar na RT por 10 minutos, pipetting para cima e para baixo ocasionalmente.
- Transfira as células e a matriz de membrana do porão dissolvida em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Adicione 1 mL de 1x PBS, gire a 300 x g por 5 min e remova o supernasciente. Repita a lavagem uma vez.
- Aspire o supernatante. Divida as células na pelota ou realize a análise do ponto final.
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Representative Results
Usando a matriz recém-projetada de três câmaras, a invasão das células foi testada na presença ou ausência de células estromas, como os fibroblastos. A invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos 3T3 suíços irradiados (cepa J2) foram semeados na câmara inferior, permitindo a troca de fatores entre as duas linhas celulares. Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3-J2 foram duplicadas em número (Figura 3A). Por outro lado, a taxa de invasão de um clone invasivo de células MCFDCIS (DCIS-Δ4)9 parece ser inibida pela conversa cruzada com células 3T3-J2 (Figura 3B). Esses dados mostram a aplicação útil do conjunto de três câmaras para medir efeitos variados do estroma, neste caso, fibroblastos, na invasão celular.
Em seguida, para monitorar a mudança nas células endoteliais motilidade e invasão em resposta a sinais de invasivos (MDA-MB-231)10,11 ou não invasivos (DCIS)12 células cancerígenas, células endoteliais veias humanas (HUVECs) que representam células endoteliais que revestem as paredes dos vasos sanguíneos. Os HUVECs foram mais invasivos em resposta a fatores secretados pelas células MDA-MB-231, ao contrário daquelas secretadas pelas células DCIS (Figura 4). Isso é consistente com a capacidade de tumores invasivos de recrutar células endoteliais para formação de vasos sanguíneos e posterior disseminação na circulação.
Os dados acima demonstram a capacidade do sistema de analisador de células de monitorar diferentes taxas de invasão de linhas celulares; quando a invasão começa, progride e planaltos. Isso permite que o usuário escolha o ponto de tempo de interesse, por exemplo, após as primeiras 2-3h de invasão, para capturar as células pioneiras que iniciam a invasão e são distintas das células seguintes que invadem a partir daí por invasão coletiva.
Embora os dados acima demonstrem uma prova sólida de princípio para o uso da matriz de três câmaras para observar a invasão em um ambiente de cocultura, queríamos testar a usabilidade potencial desta matriz em ambientes clínicos e diagnósticos. Para isso, foi monitorada a invasão de suspensões celulares de xenoenxertos derivados do paciente (PDX)8 co-cultivados com células imunes de amostras de medula óssea humanas. As células imunes da medula óssea total (MM) foram semeadas na câmara inferior com ou sem soro. A invasão de células PDX da câmara superior aumentou em resposta às células imunes BM co-cultivadas (Figura 5). Curiosamente, a presença de 2% de soro na câmara inferior com as células BM foi essencial para a invasão do PDX.
Figura 1: Fluxo de trabalho do sistema de monitoramento de invasão celular e coleta de células. (A) As células stroma são adicionadas à câmara inferior que é montada em uma câmara média, que serve como uma barreira celular permeável apenas para fatores solúveis. (B) A câmara superior com biosensores de impedância recebe a linha celular a ser monitorada. A invasão em tempo real é registrada até que um ponto de tempo definido pelo usuário para coleta de celular seja atingido. (C) A câmara superior desmontada é invertida, e as células são colhidas usando um levantador de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens das câmaras de matriz e modificações. (A) As três câmaras utilizadas para construir a matriz. Nenhuma modificação foi feita na câmara superior que abriga os eletrodos. (B) A partir dos poços da câmara média, uma altura de 2 mm foi raspada e uma membrana presa ao fundo aberto; foram adicionadas fendas longitudinais (1,5 mm x 5,6 mm) para cada lado. (C) Câmara inferior (72 mm x 18 mm) fabricada para replicar o design de 16 poços; os poços têm 4,8 mm de profundidade e 4,75 mm de diâmetro, os cumes do triângulo (1,5 mm horizontais x 1,4 mm verticais) são adicionados ao longo dos lados para clicar nas fendas da câmara média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O efeito dos fibroblastos co-cultivados na invasão de células cancerosas. (A) Análise Celular em Tempo Real da invasão celular MDA-MB-231, sozinho ou em co-cultura com fibroblastos 3T3-J2 (câmara inferior). Os fibroblastos 3T3-J2 foram semeados em 30.000 ou 60.000 células por poço. (B) Análise Celular em Tempo Real da invasão celular DCIS-Δ4, sozinha ou em co-cultura com fibroblastos 3T3-J2 (câmara inferior). Os círculos sólidos representam a média; as linhas pontilhadas finas representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O efeito das células cancerígenas na invasão celular endotelial. Análise celular em tempo real da invasão do HUVEC, sozinho, em co-cultura com as invasivas células MDA-MB-231 (câmara inferior) ou as células DCIS não invasivas (câmara inferior). Os círculos sólidos representam a média; as linhas pontilhadas finas representam o desvio padrão. Índice de células Delta normalizado para a impedância no momento = 1 h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Invasão celular de xenoenxertos derivados do paciente (PDX) co-cultivados com células imunes de medula óssea. Células únicas desintegradas do PDX (câmara superior) foram co-cultivadas com células de medula óssea humanas (câmara inferior), e sua invasão foi monitorada ao longo do tempo na presença ou ausência de soro. Os círculos sólidos representam a média; as linhas pontilhadas finas representam o desvio padrão. Índice de células Delta normalizado para a impedância no momento = 1 h e 36 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mídia | Constituintes | Concentração/proporção |
| Mídia MDA-MD-231 | DMEM | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | 10% | |
| Mídia J2 Fibroblasts | DMEM | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | 10% | |
| Mídia DCIS | DMEM F12 | |
| Soro de cavalo (HS) | 5% | |
| Fator de crescimento epidérmico (EGF) | 20 ng/mL | |
| Insulina | 10 μg/mL | |
| Hidrocortisona | 0,5 μg/mL | |
| Toxina de cólera | 100 ng/mL | |
| Mídia PDX | DMEM F12 | |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | 2% | |
| HEPES | 1 M | |
| Insulina Transferrin Selênio Ethanolamine (ITS) | 10 μg/mL | |
| Hidrocortisona | 0,5 μg/mL | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 1 mg/mL |
Tabela 1: Composição de mídia de cultura celular. A tabela lista as composições de mídia MDA-MD-231, mídia J2 Fibroblasts, mídia DCIS e mídia PDX.
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Discussion
Modificamos o projeto de uma matriz de câmara dupla para incluir uma terceira câmara para monitorar a invasão celular em tempo real na presença de células estromicas. Observamos efeitos distintos de fibroblastos co-cultivados em células cancerígenas invasivas e não invasivas indicando que a matriz pode ser usada para distinguir entre subpopulações de células cancerosas que respondem de forma diferente aos fatores produzidos por células estrogonais co-cultivadas. A matriz também foi usada para monitorar a invasão de células endoteliais em tecidos estroma, um passo crítico durante os vasos sanguíneos que brotam em direção a um estímulo angiogênico na presença de células cancerosas de diferentes potenciais invasivos. Esses experimentos mostram o uso versátil da matriz para o isolamento de células cancerosas ou outras células.
Recomenda-se otimizar o número de células a serem adicionadas a cada câmara. Pela nossa experiência e recomendação do fabricante, 30.000-50.000 células são ótimas. Uma vez que dois tipos de células podem ser co-cultivados nesta matriz, um dos quais pode ser uma cultura primária de células estroma, sugere-se monitorar os efeitos de diferentes mídias em células usadas para manter a viabilidade. Descobrimos que a fome de células a serem monitoradas reduz a variação entre as réplicas. Se as condições de crescimento sem soro são prejudiciais para as células, podem ser usados baixos tempos de sorum e menor fome. A adição de uma baixa quantidade de soro (1%-2%) pode ser fundamental para a sobrevivência de células estrômicas (células primárias) na câmara inferior, mas certifique-se de incluir as condições adequadas de controle para interpretação de dados (ou seja, 2% de soro com e sem células estromicas). Se as taxas de invasão forem baixas, mais poços por condição experimental podem aumentar o número de células viáveis coletadas para análises a jusante. Ao analisar biópsias do paciente, a desintegração do tecido em células únicas é crucial antes de testar na placa analisadora celular. Otimizar as condições de desintegração para manter a viabilidade celular é um passo importante antes de realizar a análise da invasão. Também é possível estudar aspectos adicionais da invasão, como a sensibilidade ao tratamento medicamentoso ou o efeito de componentes da matriz extracelular do porão (ECM) na taxa de invasão. O ECM é um componente essencial do microambiente e foi relatado que desempenha um papel importante durante a invasãocelular 13. Vários estudos publicados têm usado o ECM para revestir a câmara superior antes que as células invasoras sejam adicionadas para monitorar sua interação com vários componentes do ECM14,15. A matriz de três câmaras é uma ferramenta útil para estudar interações de cocultura entre células invasivas e estroma. Embora o desenho proposto garanta uma coleção celular específica para as células invasoras sem células estromas, essa configuração pode não ser ótima se a conversa cruzada entre as células exigir a interação física dos diferentes tipos de células. Além disso, as células não aderentes que crescem em suspensão não podem ser coletadas nos métodos propostos aqui (sucateamento), mas uma abordagem diferente na qual a mídia nas câmaras desmontadas contendo as células não aderentes pode ser coletada para colher as células não-aderentes.
Embora esta matriz possa ser utilizada para múltiplas áreas de pesquisa que monitoram a invasão celular na presença de um componente estromâneo, aqui nos concentramos na invasão de células cancerosas e como essa abordagem pode descobrir subpopulações de células cancerígenas malignas presentes em amostras biológicas heterogêneas. A nova capacidade da matriz de três câmaras utilizada aqui fornece um ensaio funcional para isolar subpopulações invasivas de misturas heterogêneas de células cancerígenas heterogêneas que contêm células cancerígenas cada vez menos invasivas. A análise de subpopulações invasivas e relevantes para o resultado é essencial para estudos mecanicistas adequados e insights moleculares não obtêveis ou tendenciosos pela análise de uma população celular mista. A câmara de co-cultura para células estromas fornece insights sobre a conversa entre células celulares no microambiente tumoral durante a progressão para doenças invasivas.
Como um passo em direção à aplicação de amostras de tecido, por exemplo, biópsias tumorais de pacientes, usamos células cancerígenas que foram isoladas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente (PDXs) e testamos o impacto das células de medula óssea humanas na invasão de células tumorais. Conseguimos coletar as células invasoras presentes nos PDXs para análise a jusante, ou seja, RNA-seq. O ensaio dos PDXs é o passo inicial para a análise das subpopulações celulares presentes na mistura heterogênea de células cancerígenas em biópsias tumorais obtidas de pacientes. O objetivo final será usar tais biópsias tumorais e isolar subpopulações de células cancerosas que invadem e, assim, impulsionam resultados ruins devido ao seu potencial de propagação metastática. A identificação das características moleculares e o teste da sensibilidade dessas subpopulações invasivas ao tratamento medicamentoso são aplicações futuras.
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Disclosures
A Universidade de Georgetown registrou uma patente relacionada a algumas das abordagens descritas neste manuscrito. G.M.S, A.W, L.D. e M.P. são nomeados como inventores nesta aplicação e declaram isso como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA205632, R21CA226542 e, em parte, por subvenção da Agilent Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
| Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
| Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
| RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
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