Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.
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Artigo de método
Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Invasão e propagação metastática de células cancerígenas são a principal causa de morte por câncer. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações de células cancerosas normalmente geram uma única medição de ponto final que não distingue entre subpopulações de células cancerosas com diferentes potenciais invasivos. Além disso, o microambiente tumoral consiste em diferentes células estrômicas residentes e imunes que alteram e participam do comportamento invasivo das células cancerosas. A invasão aos tecidos também desempenha um papel nas subpopulações de células imunes que se defendem de microrganismos ou eliminam células doentes das células parenchyma e endotelial durante a remodelação tecidual e angiogênese. A Análise Celular em Tempo Real (RTCA) que utiliza biosensores de impedância para monitorar a invasão celular foi um grande passo em frente além da medição do ponto final da invasão: isso fornece medições contínuas ao longo do tempo e, portanto, pode revelar diferenças nas taxas de invasão que são perdidas no ensaio de ponto final. Usando a tecnologia RTCA atual, expandimos matrizes de câmara dupla adicionando uma câmara adicional que pode conter células estrômicas e/ou imunes e permite medir a taxa de invasão sob a influência de fatores secretados de células estromais ou imunes co-cultivadas ao longo do tempo. Além disso, o design único permite desprender câmaras a qualquer momento e isolar a célula cancerígena mais invasiva, ou outras subpopulações celulares que estão presentes em misturas heterogêneas de isolados tumorais testados. Essas células cancerígenas mais invasivas e outras subpopulações celulares impulsionam a progressão maligna para doenças metastáticas, e suas características moleculares são importantes para estudos mecanicistas aprofundados, o desenvolvimento de sondas diagnósticas para sua detecção e a avaliação de vulnerabilidades. Assim, a inclusão de drogas de pequenas ou grandes moléculas pode ser usada para testar o potencial de terapias que visam o câncer e/ou subpopulações de células estromicas com o objetivo de inibir (por exemplo, células cancerosas) ou melhorar (por exemplo, células imunes) comportamento invasivo.
Introdução
A invasão celular é um processo importante que permite que as células cruzem barreiras de membrana de porão em resposta a pistas ambientais fornecidas por células estromas. É um passo crucial durante vários estágios de desenvolvimento para respostas imunes, cicatrização de feridas, reparação de tecidos e malignidades que podem progredir de lesões locais para cânceres invasivos e metastáticos1. Ensaios desenvolvidos desde cedo para medir o potencial invasivo das populações celulares normalmente geram uma única medição de ponto final ou requerem pré-rotulagem de células invasoras2. A integração das técnicas de microeletrôn....
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Protocolo
O estudo foi revisado e considerado como "isento" pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Georgetown (IRB # 2002-022). Os tecidos de medula óssea recém-colhidos foram coletados a partir de filtros descartados de coleta de medula óssea humana saudável que haviam sido desidentificulados.
1. Novo desenho de câmara (Figura 2)
- Abra uma nova placa de analisador de células de câmara dupla. Reserve a câmara superior com eletrodos.
- Usando uma máquina de fresar, raspe 2 mm dos poços inferiores em forma de U da placa analisadora de células.
- ....
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Resultados
Usando a matriz recém-projetada de três câmaras, a invasão das células foi testada na presença ou ausência de células estromas, como os fibroblastos. A invasão celular MDA-MB-231 foi reforçada quando os fibroblastos 3T3 suíços irradiados (cepa J2) foram semeados na câmara inferior, permitindo a troca de fatores entre as duas linhas celulares. Curiosamente, a invasão MDA-MB-231 aumentou quando as células 3T3-J2 foram duplicadas em número (Figura 3A). Por outro lado, a taxa de invasão de um cl.......
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Discussão
Modificamos o projeto de uma matriz de câmara dupla para incluir uma terceira câmara para monitorar a invasão celular em tempo real na presença de células estromicas. Observamos efeitos distintos de fibroblastos co-cultivados em células cancerígenas invasivas e não invasivas indicando que a matriz pode ser usada para distinguir entre subpopulações de células cancerosas que respondem de forma diferente aos fatores produzidos por células estrogonais co-cultivadas. A matriz também foi usada para monitorar a invasão de célul.......
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Divulgações
A Universidade de Georgetown registrou uma patente relacionada a algumas das abordagens descritas neste manuscrito. G.M.S, A.W, L.D. e M.P. são nomeados como inventores nesta aplicação e declaram isso como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à Dra. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01CA205632, R21CA226542 e, em parte, por subvenção da Agilent Technologies.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| Adesivo | Norland Adesivo Óptico | NOA63 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Levantador de células | Sarstedt | 83.1832 | |
| Toxina da cólera de Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-placa | Placa do analisador de células | 5665817001 | |
| Colagenase de Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
| Dispase | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| Soro Bovino Fetal (FBS), Inativado por Calor | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| Soro de cavalo (HS) | Gibco | 16050-122 | |
| EGF humano | Peprotech | AF-100-15 | |
| Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) | LONZA (RRID: CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
| Hidrocortisona | Sigma | H4001 | |
| Insulina Transferrina Selênio Etanolamina (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
| Insulina, Recombinante Humana, Solução de Zinco | Sigma | C8052 | |
| J2 Fibroblastos | Células-tronco (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Meio de gradiente de densidade para o isolamento de células mononucleares |
| Matrigel | Corning | 354230 | Matriz de membrana basal |
| MCFDCIS.com células ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
| células MDA-MB-231 | RRID:CVCL_0062 | ||
| Fresadora | Bridgeport Série 1 Vertical | ||
| Phosphate-buffered salina (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
| Polietersulfona ( PES) | Sterlitech | PCTF029030 | |
| solução de lise de hemácias | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| RTCA Analisador DP | Agilent | 3X16 | Analisador de células de dupla finalidade |
| Tripsina | Sigma | T4799 |
Referências
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of anti....
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Reimpressões e permissões
