在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。
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本文内容
摘要
摘要
眼病包括多种遗传性和获得性病变，由于可通过多种给药途径相对容易地进行局部给药，这些疾病成为局部药物递送的理想靶点。与其它眼内给药途径相比，结膜下注射（SCJ）具有操作简便、安全性高、通常可在门诊条件下完成等优势。由于小动物眼球尺寸较小，进行结膜下注射通常需要手术显微镜的辅助。已有研究表明，特定血清型的腺相关病毒（AAV）通过结膜下注射是一种有效的基因递送策略，可实现对眼表、眼外肌、角膜及视神经的靶向转导，为多种眼病的治疗提供了潜在途径。
本文介绍了一种在小鼠模型中进行巩膜睫状体交界区（SCJ）注射的详细实验方案，所用注射系统包括可编程输注/回抽式注射泵（可实现稳定且精确的注射速度与压力）以及与微注射针头连接的无泄漏可拆卸注射器。该注射系统亦可适用于小动物其他眼内给药途径，如角膜基质内、前房内、玻璃体内及视网膜下注射。尽管文中以腺相关病毒载体（AAV）在眼科基因治疗研究中的递送为例进行描述，但本方案亦可适用于多种小动物模型中的眼科溶液给药。本文将详细讨论该给药途径的关键操作步骤、注射平台的设置、注射前准备以及来自实际操作经验的技术要点。此外，还将简要介绍用于确认AAV成功递送至目标组织的常用验证技术。
引言
眼病包括多种遗传性和获得性疾病。2015年，全球约有3600万人被认定为法定盲人，超过10亿人至少存在一定程度的视力障碍，这凸显了在各个层面加强防治工作的迫切需求1。眼部药物递送的主要方法包括局部给药和眼内局部注射，例如滴眼液或结膜下（SCJ）、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。尽管无创的局部治疗是眼科药物最常用的给药方式，并广泛用于多种眼前段疾病，但角膜解剖屏障的存在限制了局部给药物质的生物利用度、生物分布和疗效，提示该方法可能并非治疗许多眼内疾病的最佳选择。将药物直接注射至受累的眼内特定腔室可能是更有效且靶向性更强的给药策略2。然而，反复注射可能引发不良反应，使治疗方案复杂化。理想的治疗方法应在单次给药后即可维持长期的治疗效果。因此，基因治疗有望减少所需注射次数，并实现外源基因的持续表达，为治疗眼病提供一种极具前景的方案3,4。
目前有多种病毒性和非病毒性载体可用于基因治疗，但腺相关病毒（AAV）载体因其出色的安全性而备受关注。AAV是一种小的、单链、无包膜的DNA病毒，最初由Atchison等人于1965年在腺病毒制备物中作为污染物发现5,6。随....
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方案
所有动物实验均按照北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会的规定进行。使用腺相关病毒（AAV）载体属于生物安全等级1级的生物危害风险。在操作AAV时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。在本实验中，采用了一种重组AAV载体，该载体包装了8型血清型衣壳，并携带由通用的普遍性巨细胞病毒（CMV）启动子控制绿色荧光蛋白（GFP）表达的编码序列。
1. AAV 载体的处理与保存
- 将病毒以100 µL分装于硅化或低吸附的微量离心管中，于-80 °C冰箱中保存。
- 使用前将所有载体储存液置于冰上解冻。
注意：通常将荧光素钠溶液等染料（终浓度为0.1–2%）与AAV载体混合，以可视化注射溶液。此外，观察注射溶液有助于检测气泡，并监测注射后AAV的分布情况和/或渗漏情况。
2. 结膜下（SCJ）注射
- 组装注射系统。
- 组装注射系统时，将体视显微镜和注射泵放置于生物安全柜中。
注意：需要使用输注泵以高精度进行注射。本实验采用标准推注/回抽可编程注射泵（见材料表），该泵配备牢固的夹持装置和适用于0.5 µL至60 mL注射器的安全夹具。该泵还提供增强的流体性能，具有高准确性....
- 组装注射系统时，将体视显微镜和注射泵放置于生物安全柜中。
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结果
注入结膜下腔的溶液会根据注射体积形成一个水疱样隆起（bleb）。
本实验中，在体视显微镜下使用36 G针头注射7 µL AAV（7 × 109 病毒基因组拷贝 (vg)/眼），其中混合荧光素至终浓度为0.1%；采用可编程注射泵以1 µL/s的速度恒定控制注射速率/压力。注射时可见水疱样隆起形成（箭头所示）。小鼠结膜下腔（SCJ）给予AAV载体的显微图像见图1。
注入结膜下间隙的物质会扩散至眼球周围，并分布于眼周组织中。
为了明确通过结膜下注射（SCJ）给予的腺相关病毒（AAV）的分布情况，将7 µL稀释的印度墨水注射到一只10月龄小鼠的结膜下间隙，注射前已进行麻醉。在SCJ注射过程中及注射后均未观察到出血、渗漏或回流现象。注射30分钟后，取眼球及周围组织，并用苏木精和伊红（H&E）染色以观察印度墨水的分布情况。图2 所示的代表性矢状切片显示，印度墨水主.......
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讨论
腺相关病毒介导的基因治疗在治疗眼部疾病方面具有巨大潜力。目前的眼部基因治疗主要依赖两种局部给药途径：玻璃体内注射和视网膜下注射。然而，这两种途径均具有侵入性，可能引起严重并发症，包括视网膜脱离、白内障形成和眼内炎。因此，探索相对创伤较小的给药途径（如结膜下注射）具有重要意义。
尽管该技术相对简单且侵入性显著较低，但仍需强调腺相关病毒（AAV）递送过程中的几个重要方面。 建议将AAV载体分装于硅化或低吸附的微量离心管中，每管体积为所需体积（本实验为100 µL），并在-80 °C保存，以避免反复冻融，防止病毒滴度下降。本实验所用载体在-80 °C保存约6年，未出现滴度显著降低的情况。此外，载体的组成可能影响病毒载体的稳定性。本实验中，病毒载体为含350 mM NaCl和5% D-山梨醇的磷酸盐缓冲液（PBS）。本研究所用病毒的滴度为5.1 × 109 vg/µL（通过qPCR测定），每眼注射总量为7 × 109 vg。然而，根据靶组织和目的基因的不同，每眼注射1 × 108–1 × 1010
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢北卡罗来纳大学病毒载体核心实验室（Vector Core at the University of North Carolina）提供本研究中使用的scAAV8-GFP载体，感谢CGIBD组织学核心实验室（CGIBD Histology Core），以及Brian C. Gilger博士实验室在本研究临床评估部分提供的协助。本研究得到了辉瑞-北卡生物技术中心杰出博士后奖学金（Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship）以及美国基因与细胞治疗学会职业发展奖（Career Development Award from the American Society of Gene）的资助。 & 细胞治疗与囊性纤维化基金会 内容完全由作者负责，并不一定代表美国基因学会的官方观点 & 细胞治疗或囊性纤维化基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 36 G NanoFil 针头 | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV 载体 | 北卡罗来纳大学教堂山分校 | / | |
| 乙酰丙嗪 | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| 抗 GFP 抗体 | AVES Labs 公司 | ||
| 数码相机 | 佳能 | 佳能 EOS T5i | |
| DNA/RNA 提取试剂盒 | Qiagen | 80204 | |
| 镊子 | 精细科学工具公司 | F6521 | |
| 哈密尔顿注射器 | Hamilton | 7654-01 | |
| 印度墨水 | StatLab | NC9903975 | |
| 盐酸氯胺酮注射液 | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| 防潮膜 | Parafilm | 807-6 | |
| 聚乙烯导管 | 贝克顿·迪金森公司 | 427401 | |
| 0.1% 丙帕卡因 | Bausch Health 美国公司 | NDC 24208-730-06 | |
| 回弹式眼压计 | Tonovet | / | |
| 荧光素钠溶液 | Sigma-Aldrich | 46960 | |
| 标准推注/抽取泵 11 Pico Plus Elite 可编程注射泵 | 哈佛生物科学公司 | 70-4504 | |
| 体视显微镜 | 徕卡 | Mz6 | |
| 0.5% 盐酸丁卡因眼科溶液 | 博士伦公司 | 处方药 | |
| 局部眼膏 | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| 赛拉嗪 | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick 酚红棉线盒（100 根） | ZONE-QUICK | PO6448 |
参考文献
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C.
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重印与许可
