Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali
Summary
In questo manoscritto, l’iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.
Abstract
Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie genetiche ereditarie e acquisite che sono obiettivi interessanti per la somministrazione locale di farmaci a causa della loro relativa facilità di accessibilità attraverso più vie di somministrazione. Le iniezioni subcongiuntivali (SCJ) offrono vantaggi rispetto ad altre vie di somministrazione intraoculare in quanto sono semplici, sicure e di solito eseguite in un ambiente ambulatoriale. Le iniezioni di SCJ in piccoli animali di solito richiedono l’assistenza di un microscopio operatorio a causa delle dimensioni dell’occhio. Lavori precedenti hanno dimostrato che l’iniezione SCJ di specifici sierotipi di virus adeno-associati (AAV) è una valida strategia di consegna genica per la trasduzione mirata della superficie oculare, del muscolo oculare, della cornea e del nervo ottico, fornendo un potenziale approccio per il trattamento di molte malattie oculari.
Qui viene presentato un protocollo dettagliato per le iniezioni di SCJ in un modello murino utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi per microiniezione. Il sistema di iniezione è adattabile anche per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Sebbene sia descritto il rilascio di vettori virali adeno-associati per studi di terapia genica oculare, il protocollo qui contenuto può anche essere adattato per una varietà di soluzioni oftalmiche in piccoli modelli animali. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell’iniezione e i suggerimenti dall’esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Inoltre, saranno brevemente discusse anche le tecniche di convalida comuni per la conferma della consegna di AAV ai tessuti desiderati.
Introduction
Le malattie oculari comprendono una vasta gamma di malattie sia genetiche che acquisite. Nel 2015, circa 36 milioni di persone erano legalmente cieche in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone soffre di almeno un certo livello di disabilità visiva, evidenziando la necessità di aumentare gli sforzi di alleviamento a tutti i livelli1. I principali metodi per la somministrazione di farmaci oculari includono sia la somministrazione topica che locale, come colliri o iniezioni subcongiuntivali (SCJ), intracamerali, intravitreali e sottoretiniche. Sebbene la terapia topica non invasiva sia il metodo di somministrazione più comune per i farmaci oftalmici e sia ampiamente utilizzata per molti disturbi del segmento anteriore, la presenza di barriere anatomiche corneali presenta una sfida per la biodisponibilità, la biodistribuzione e l’efficacia delle sostanze somministrate localmente, suggerendo che potrebbe non essere la migliore via di trattamento candidata per molte malattie dell’occhio interno. L’iniezione locale nello specifico compartimento oculare interessato dalla malattia è probabilmente un approccio di somministrazione del farmaco più efficace e mirato2. Tuttavia, gli effetti avversi derivanti da iniezioni ripetute possono complicare le strategie di somministrazione. Idealmente, una terapia dovrebbe mantenere l’efficacia terapeutica a lungo termine dopo una singola somministrazione. Pertanto, la terapia genica è un’opzione promettente per ridurre al minimo il numero di iniezioni necessarie e fornire un’espressione transgenica sostenuta per il trattamento della malattia oculare 3,4.
Numerosi vettori virali e non virali sono disponibili per la terapia genica; tuttavia, i vettori AAV sono di grande interesse a causa del loro eccellente profilo di sicurezza. AAV è un piccolo virus a DNA a singolo filamento e senza involucro che è stato inizialmente scoperto come contaminante di una preparazione di adenovirus nel 1965 da Atchison et al.5,6 AAV è stato successivamente progettato come un vettore virale efficiente per la consegna genica nel 1980 ed è diventato il vettore di terapia genica di scelta per molte malattie, compresi i disturbi oculari, negli ultimi decenni. Il più notevole di questi è il primo farmaco di terapia genica disponibile in commercio, voretigene neparvovec, che è stato approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti per trattare l’amaurosi congenita di Leber, una rara malattia dell’occhio posteriore. Sebbene voretigene neparvovec abbia superato con successo le barriere allo sviluppo clinico, permangono sfide per la commercializzazione di ulteriori terapie geniche oculari. Ad esempio, voretigene neparvovec viene somministrato a pazienti che conservano cellule retiniche vitali tramite iniezione sottoretinica. Pertanto, i pazienti con forme più avanzate della malattia che mancano di cellule retiniche vitali non sono eleggibili per il trattamento, in quanto non fornirebbe alcun beneficio clinico. Inoltre, sono state osservate complicanze note associate alla procedura di iniezione sottoretinica, tra cui infiammazione oculare, cataratta, lacrimazione della retina, maculopatia e dolore 7,8. Altre preoccupazioni relative a questa procedura includono la possibilità di emorragia, distacco di retina, endoftalmite e revoca dello stato di privilegiato immunitario oculare attraverso la distruzione del tessuto oculare 9,10,11,12. Pertanto, gli sforzi per esplorare vie di consegna genica meno invasive come l’iniezione di SCJ sono diventati sempre più importanti 13,14,15,16,17.
La congiuntiva è una sottile membrana contenente 3-5 strati di cellule e che collega l’occhio anteriore alla palpebra interna. Le iniezioni di SCJ sono utilizzate clinicamente per la somministrazione di farmaci oftalmici sia ai segmenti anteriore che / o posteriore dell’occhio per il trattamento di malattie oculari come la degenerazione maculare legata all’età, il glaucoma, la retinite e l’uveite posteriore18,19. Sono relativamente semplici da eseguire, impiegati di routine per la somministrazione di farmaci oftalmici in un ambiente ambulatoriale20, in qualche modo indolori, non compromettono il privilegio immunitario oculare e consentono ai farmaci somministrati di diffondersi attraverso un’ampia regione periorbitale che comprende il nervo ottico. Pertanto, le iniezioni di SCJ sono una via di somministrazione interessante per le applicazioni di terapia genica AAV. I sierotipi naturali AAV somministrati tramite iniezione di SCJ nei topi sono stati precedentemente caratterizzati per sicurezza, efficienza di trasduzione, immunogenicità sierica, biodistribuzione e specificità tissutale13,16,21. Questi dati hanno dimostrato che la consegna genica ai singoli tessuti oculari attraverso la somministrazione di SCJ è una possibilità formale.
Questo articolo descrive un protocollo semplice e adattabile per l’iniezione di SCJ per fornire vettori AAV in un modello murino. Per garantire la riproducibilità di questo approccio, viene descritto un sistema di iniezione costituito da uno stereomicroscopio, una pompa a siringa per infusione/prelievo programmabile (che consente velocità e pressione di iniezione costanti e precise) e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema è adattabile per altre vie di somministrazione intraoculare come iniezioni intrastromali, intracamerali, intravitreali e sottoretiniche in piccoli animali. Inoltre, un colorante fluoresceina viene spesso utilizzato per consentire la visualizzazione del sito di iniezione AAV. I passaggi pratici chiave nel percorso di somministrazione, la configurazione per la piattaforma di iniezione, la preparazione dell’iniezione e i suggerimenti dall’esperienza diretta saranno discussi in dettaglio. Infine, verranno brevemente discusse le tecniche di validazione comuni per la conferma della somministrazione di AAV ai tessuti desiderati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia genica mediata da AAV ha un grande potenziale per il trattamento delle malattie oculari. L’attuale terapia genica oculare si basa su due principali vie di somministrazione locale, iniezioni intravitreali e sottoretiniche. Sfortunatamente, entrambe le vie sono invasive e possono causare gravi complicazioni, tra cui il distacco della retina, la formazione di cataratta e l’endoftalmite. Pertanto, lo studio di vie relativamente meno invasive, come l’iniezione di SCJ, è di grande interesse.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Vector Core dell’Università della Carolina del Nord per aver fornito i vettori scAAV8-GFP utilizzati in questo studio, il CGIBD Histology Core e il laboratorio del Dr. Brian C. Gilger per la loro assistenza con gli aspetti di valutazione clinica di questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship e da un Career Development Award dell’American Society of Gene & Cell Therapy e della Cystic Fibrosis Foundation. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale dell’American Society of Gene & Cell Therapy o della Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
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