Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması
Summary
Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.
Abstract
Oküler hastalıklar, çoklu uygulama yolları üzerinden göreceli olarak erişilebilirliklerinin kolaylığı nedeniyle lokal ilaç dağıtımı için cazip hedefler olan çok çeşitli kalıtsal genetik ve edinsel bozuklukları içerir. Subkonjonktival (SCJ) enjeksiyonlar, basit, güvenli ve genellikle ayakta tedavi ortamında gerçekleştirildikleri için diğer göz içi uygulama yollarına göre avantajlar sunar. Küçük hayvanlarda SCJ enjeksiyonları genellikle gözün büyüklüğü nedeniyle ameliyat mikroskobunun yardımını gerektirir. Önceki çalışmalar, spesifik adeno ilişkili virüs (AAV) serotiplerinin SCJ enjeksiyonunun, oküler yüzeyin, göz kasının ve optik sinirin hedeflenen transdüksiyonu için geçerli bir gen dağıtım stratejisi olduğunu ve birçok oküler hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım sağladığını göstermiştir.
Burada, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompasından (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncına izin veren) ve mikroenjeksiyon iğneleriyle birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak bir fare modelinde SCJ enjeksiyonları için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Enjeksiyon sistemi, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir. Oküler gen terapisi çalışmaları için adeno ilişkili viral vektörlerin verilmesi tarif edilmesine rağmen, buradaki protokol küçük hayvan modellerinde çeşitli oftalmik çözeltiler için de uyarlanabilir. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Ek olarak, istenen dokulara AAV doğum onayı için yaygın doğrulama teknikleri de kısaca tartışılacaktır.
Introduction
Oküler hastalıklar hem genetik hem de edinsel bozuklukların geniş bir yelpazesini kapsar. 2015 yılında, dünya çapında tahmini 36 milyon insan yasal olarak kördü ve 1 milyardan fazla insan en azından bir miktar görme bozukluğundan muzdaripti ve bu da hafifletme çabalarını her seviyede ölçeklendirme ihtiyacını vurguladı1. Oküler ilaçların verilmesi için ana yöntemler, göz damlası veya subkonjonktival (SCJ), intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi hem topikal hem de lokal uygulamayı içerir. Noninvaziv topikal tedavi oftalmik ilaçlar için en yaygın dağıtım yöntemi olmasına ve birçok ön segment bozukluğunda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kornea anatomik bariyerlerinin varlığı, topikal olarak uygulanan maddelerin biyoyararlanımı, biyodağılımı ve etkinliği için bir zorluk teşkil etmekte ve bu da iç gözün birçok hastalığı için en iyi aday tedavi yolu olmayabileceğini düşündürmektedir. Hastalıktan etkilenen spesifik oküler kompartmana lokal enjeksiyonun daha etkili ve hedefe yönelik bir ilaç dağıtım yaklaşımı olması muhtemeldir2. Bununla birlikte, tekrarlanan enjeksiyonlardan kaynaklanan olumsuz etkiler uygulama stratejilerini karmaşıklaştırabilir. İdeal olarak, bir terapi tek bir uygulamayı takiben uzun süreli terapötik etkinliği korumalıdır. Bu nedenle, gen tedavisi, gerekli enjeksiyon sayısını en aza indirmek ve oküler hastalığın tedavisi için sürekli transgen ekspresyonu sağlamak için umut verici bir seçenektir 3,4.
Gen tedavisi için çok sayıda viral ve viral olmayan vektör mevcuttur; Bununla birlikte, AAV vektörleri mükemmel güvenlik profilleri nedeniyle yüksek ilgi görmektedir. AAV, başlangıçta 1965 yılında Atchison ve ark. tarafından bir adenovirüs preparatının kirleticisi olarak keşfedilen küçük, tek sarmallı, zarfsız bir DNA virüsüdür.5,6 AAV daha sonra 1980’lerde gen iletimi için etkili bir viral vektör olarak tasarlanmış ve oküler bozukluklar da dahil olmak üzere birçok hastalık için tercih edilen gen terapisi vektörü haline gelmiştir. son birkaç on yılda. Bunlardan en önemlisi, nadir görülen bir arka göz hastalığı olan Leber’in Konjenital Amaurosis’ini tedavi etmek için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan ilk ticari olarak temin edilebilen gen terapisi ilacı voretigene neparvovec’tir. Voretigene neparvovec, klinik gelişimin önündeki engelleri başarıyla aşmış olsa da, ek oküler gen tedavilerinin ticarileştirilmesi için zorluklar devam etmektedir. Örneğin, voretigene neparvovec, subretinal enjeksiyon yoluyla canlı retinal hücreleri tutan hastalara uygulanır. Bu nedenle, canlı retinal hücrelerden yoksun olan hastalığın daha ileri formlarına sahip hastalar, klinik fayda sağlamayacağı için tedavi için uygun değildir. Ek olarak, göz iltihabı, katarakt, retina yırtılması, makülopati ve ağrı dahil olmak üzere subretinal enjeksiyon prosedürü ile ilişkili bilinen komplikasyonlar gözlenmiştir 7,8. Bu prosedürle ilgili diğer endişeler arasında kanama, retina dekolmanı, endoftalmi ve gözdokusu yıkımı yoluyla oküler immün ayrıcalıklı durumun iptal edilmesi olasılığı 9,10,11,12 sayılabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi daha az invaziv gen dağıtım yollarını keşfetme çabaları giderek daha önemli hale gelmiştir 13,14,15,16,17.
Konjonktiva, 3-5 kat hücre içeren ve ön gözü iç göz kapağına bağlayan ince bir zardır. SCJ enjeksiyonları klinik olarak yaşa bağlı makula dejenerasyonu, glokom, retinit ve posterior üveit gibi oküler hastalıkların tedavisinde gözün hem ön hem de / veya arka segmentlerine oftalmik ilaç verilmesi için kullanılır18,19. Uygulanması nispeten basittir, ayaktantedavi ortamında oftalmik ilaç dağıtımı için rutin olarak kullanılırlar, biraz ağrısızdırlar, oküler immün ayrıcalıktan ödün vermezler ve uygulanan ilaçların optik siniri kapsayan geniş bir periorbital bölgeye yayılmasına izin verirler. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonları AAV gen terapisi uygulamaları için cazip bir uygulama yoludur. Farelerde SCJ enjeksiyonu ile uygulanan doğal AAV serotipleri daha önce güvenlik, transdüksiyon etkinliği, serum immünojenisitesi, biyodağılım ve doku özgüllüğü 13,16,21 ile karakterize edilmiştir. Bu veriler, SCJ uygulaması yoluyla bireysel oküler dokulara gen iletiminin resmi bir olasılık olduğunu göstermiştir.
Bu yazıda, bir fare modelinde AAV vektörleri sunmak için SCJ enjeksiyonu için basit ve uyarlanabilir bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşımın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, bir stereomikroskop, programlanabilir bir infüzyon / geri çekilme şırınga pompası (tutarlı ve hassas enjeksiyon hızı ve basıncı sağlayan) ve mikroenjeksiyon iğneleri ile birleştirilmiş gaz geçirmez çıkarılabilir bir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Bu sistem, küçük hayvanlarda intrastromal, intrakameral, intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar gibi diğer göz içi uygulama yolları için uyarlanabilir. Ek olarak, AAV enjeksiyon bölgesinin görselleştirilmesine izin vermek için sıklıkla bir floresein boyası kullanılır. Uygulama yolundaki temel pratik adımlar, enjeksiyon platformu için kurulum, enjeksiyonun hazırlanması ve doğrudan deneyimden elde edilen ipuçları ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Son olarak, istenen dokulara AAV iletiminin doğrulanması için yaygın validasyon teknikleri kısaca tartışılacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV aracılı gen tedavisi, oküler hastalıkların tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. Günümüzde oküler gen tedavisi intravitreal ve subretinal enjeksiyonlar olmak üzere iki ana lokal uygulama yoluna dayanmaktadır. Ne yazık ki, her iki yol da invazivdir ve retina dekolmanı, katarakt oluşumu ve endoftalmi gibi ciddi komplikasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, SCJ enjeksiyonu gibi nispeten daha az invaziv yolların araştırılması büyük ilgi çekicidir.
Bu teknik nispeten ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışmada kullanılan scAAV8-GFP vektörlerini, CGIBD Histoloji Çekirdeğini ve Dr. Brian C. Gilger’in laboratuvarını bu çalışmanın klinik değerlendirme yönleriyle ilgili yardımları için sağladıkları için Kuzey Carolina Üniversitesi’ndeki Vector Core’a teşekkür eder. Bu çalışma, Pfizer-NC Biotech Seçkin Doktora Sonrası Bursu ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği ve Kistik Fibroz Vakfı’ndan Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği veya Kistik Fibroz Vakfı’nın resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch’s layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
