Administration sous-conjonctivale de vecteurs de virus adéno-associés dans des modèles de petits animaux
Summary
Dans ce manuscrit, l’injection sous-conjonctivale est démontrée comme une méthode d’administration vectorielle valide pour les tissus oculaires chez la souris utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue de perfusion / retrait et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Ce système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires.
Abstract
Les maladies oculaires comprennent un large éventail de maladies génétiques héréditaires et acquises qui sont des cibles attrayantes pour l’administration locale de médicaments en raison de leur relative facilité d’accès via de multiples voies d’administration. Les injections sous-conjonctivales (SCJ) offrent des avantages par rapport aux autres voies d’administration intraoculaires car elles sont simples, sûres et généralement effectuées en ambulatoire. Les injections de SCJ chez les petits animaux nécessitent généralement l’aide d’un microscope opératoire en raison de la taille de l’œil. Des travaux antérieurs ont démontré que l’injection par SCJ de sérotypes spécifiques de virus adéno-associés (AAV) est une stratégie d’administration génique valide pour la transduction ciblée de la surface oculaire, du muscle oculaire, de la cornée et du nerf optique, offrant une approche potentielle pour le traitement de nombreuses maladies oculaires.
Ici, un protocole détaillé est présenté pour les injections de SCJ dans un modèle murin utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Le système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamériennes, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. Bien que l’administration de vecteurs viraux adéno-associés pour les études de thérapie génique oculaire soit décrite, le protocole présent peut également être adapté à une variété de solutions ophtalmiques dans de petits modèles animaux. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. En outre, les techniques de validation courantes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront également brièvement discutées.
Introduction
Les maladies oculaires englobent un large éventail de troubles génétiques et acquis. En 2015, on estimait à 36 millions le nombre de personnes aveugles au sens de la loi dans le monde et à plus d’un milliard le nombre de personnes souffrant d’au moins un certain niveau de déficience visuelle, ce qui souligne la nécessité d’intensifier les efforts d’atténuation à tous les niveaux1. Les principales méthodes d’administration des médicaments oculaires comprennent l’administration topique et locale, comme les gouttes oculaires ou sous-conjonctivales (SCJ), les injections intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes. Bien que le traitement topique non invasif soit la méthode d’administration la plus courante pour les médicaments ophtalmiques et qu’il soit largement utilisé pour de nombreux troubles du segment antérieur, la présence de barrières anatomiques cornéennes présente un défi pour la biodisponibilité, la biodistribution et l’efficacité des substances administrées par voie topique, ce qui suggère que ce n’est peut-être pas la meilleure voie de traitement candidate pour de nombreuses maladies de l’œil interne. L’injection locale dans le compartiment oculaire spécifique affecté par la maladie est susceptible d’être une approche d’administration de médicaments plus efficace et ciblée2. Cependant, les effets indésirables résultant d’injections répétées peuvent compliquer les stratégies d’administration. Idéalement, une thérapie devrait maintenir son efficacité thérapeutique à long terme après une administration unique. Ainsi, la thérapie génique est une option prometteuse pour minimiser le nombre d’injections nécessaires et fournir une expression transgénique soutenue pour le traitement de la maladie oculaire 3,4.
De nombreux vecteurs viraux et non viraux sont disponibles pour la thérapie génique; cependant, les vecteurs AAV présentent un grand intérêt en raison de leur excellent profil d’innocuité. AAV est un petit virus à ADN simple brin non enveloppé qui a été initialement découvert comme contaminant d’une préparation d’adénovirus en 1965 par Atchison et al.5,6 L’AAV a ensuite été conçu comme un vecteur viral efficace pour l’administration de gènes dans les années 1980 et est devenu le vecteur de thérapie génique de choix pour de nombreuses maladies, y compris les troubles oculaires, au cours des dernières décennies. Le plus notable d’entre eux est le premier médicament de thérapie génique disponible dans le commerce, voretigene neparvovec, qui a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour traiter l’amaurose congénitale de Leber, une maladie oculaire postérieure rare. Bien que voretigene neparvovec ait réussi à surmonter les obstacles au développement clinique, des défis subsistent pour la commercialisation de thérapies géniques oculaires supplémentaires. Par exemple, voretigene neparvovec est administré aux patients qui conservent des cellules rétiniennes viables par injection sous-rétinienne. Ainsi, les patients atteints de formes plus avancées de la maladie qui manquent de cellules rétiniennes viables ne sont pas éligibles au traitement, car il n’apporterait aucun bénéfice clinique. De plus, des complications connues associées à la procédure d’injection sous-rétinienne ont été observées, notamment une inflammation oculaire, des cataractes, des déchirures rétiniennes, une maculopathie et des douleurs 7,8. D’autres préoccupations liées à cette procédure comprennent la possibilité d’hémorragie, de décollement de la rétine, d’endophtalmie et de révocation du statut privilégié immunitaire oculaire par destruction des tissus oculaires 9,10,11,12. Ainsi, les efforts visant à explorer des voies d’administration de gènes moins invasives telles que l’injection de SCJ sont devenus de plus en plus importants 13,14,15,16,17.
La conjonctive est une fine membrane contenant 3 à 5 couches de cellules et reliant l’œil antérieur à la paupière interne. Les injections de SCJ sont utilisées cliniquement pour l’administration de médicaments ophtalmiques aux segments antérieur et / ou postérieur de l’œil pour le traitement de maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, le glaucome, la rétinite et l’uvéite postérieure18,19. Ils sont relativement simples à réaliser, utilisés couramment pour l’administration de médicaments ophtalmiques en ambulatoire20, quelque peu indolores, ne compromettent pas le privilège immunitaire oculaire et permettent aux médicaments administrés de se propager dans une grande région périorbitaire qui englobe le nerf optique. Par conséquent, les injections de SCJ sont une voie d’administration intéressante pour les applications de thérapie génique AAV. Les sérotypes naturels AAV administrés par injection de SCJ chez la souris ont déjà été caractérisés pour leur innocuité, leur efficacité de transduction, leur immunogénicité sérique, leur biodistribution et leur spécificité tissulaire13,16,21. Ces données ont démontré que l’administration de gènes à des tissus oculaires individuels par administration de SCJ est une possibilité formelle.
Cet article décrit un protocole simple et adaptable pour l’injection de SCJ afin de délivrer des vecteurs AAV dans un modèle murin. Pour assurer la reproductibilité de cette approche, un système d’injection composé d’un stéréomicroscope, d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche aux gaz couplée à des aiguilles de micro-injection est décrit. Ce système est adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. De plus, un colorant fluorescéine est souvent utilisé pour permettre la visualisation du site d’injection d’AAV. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. Enfin, les techniques de validation communes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront brièvement discutées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La thérapie génique médiée par AAV présente un grand potentiel pour le traitement des maladies oculaires. La thérapie génique oculaire actuelle repose sur deux voies d’administration locales majeures, les injections intravitréennes et sous-rétiniennes. Malheureusement, les deux voies sont invasives et peuvent entraîner de graves complications, notamment un décollement de la rétine, la formation de cataracte et une endophtalmie. Ainsi, l’étude de voies relativement moins invasives, telles que l’injectio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Vector Core de l’Université de Caroline du Nord d’avoir fourni les vecteurs scAAV8-GFP utilisés dans cette étude, le CGIBD Histology Core et le laboratoire du Dr Brian C. Gilger pour leur aide dans les aspects d’évaluation clinique de cette étude. Cette étude a été soutenue par la bourse postdoctorale distinguée Pfizer-NC Biotech et une bourse de développement de carrière de l’American Society of Gene & Cell Therapy et de la Cystic Fibrosis Foundation. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’American Society of Gene & Cell Therapy ou de la Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
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