I dette manuskript demonstreres subkonjunktival injektion som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært væv hos mus ved hjælp af et injektionssystem bestående af en infusions- / tilbagetrækningssprøjtepumpe og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette injektionssystem kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje.
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af arvelige genetiske og erhvervede lidelser, der er tiltalende mål for lokal lægemiddellevering på grund af deres relative lette tilgængelighed via flere administrationsveje. Subkonjunktivale (SCJ) injektioner giver fordele i forhold til andre intraokulære administrationsveje, da de er enkle, sikre og normalt udføres i en ambulant indstilling. SCJ-injektioner i små dyr kræver normalt hjælp fra et operativt mikroskop på grund af øjets størrelse. Tidligere arbejde har vist, at SCJ-injektion af specifikke adeno-associerede virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi til målrettet transduktion af den okulære overflade, øjenmuskel, hornhinde og synsnerve, hvilket giver en potentiel tilgang til behandling af mange okulære sygdomme.
Heri præsenteres en detaljeret protokol for SCJ-injektioner i en musemodel ved hjælp af et injektionssystem bestående af en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som giver mulighed for ensartet og præcis injektionshastighed og tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Injektionssystemet kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Selvom levering af adeno-associerede virale vektorer til okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen heri også tilpasses til en række oftalmiske opløsninger i smådyrsmodeller. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Derudover vil almindelige valideringsteknikker til AAV-leveringsbekræftelse til det ønskede væv også blive kort diskuteret.
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af både genetiske og erhvervede lidelser. I 2015 var anslået 36 millioner mennesker juridisk blinde på verdensplan, og over 1 milliard mennesker lider af mindst en vis grad af synshandicap, hvilket understreger behovet for at opskalere lindringsindsatsen på alle niveauer1. De vigtigste metoder til levering af okulær medicin omfatter både topisk og lokal administration, såsom øjendråber eller subkonjunktivale (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner. Selvom ikke-invasiv topisk terapi er den mest almindelige leveringsmetode for oftalmiske lægemidler og i vid udstrækning anvendes til mange forreste segmentforstyrrelser, udgør tilstedeværelsen af hornhinde anatomiske barrierer en udfordring for biotilgængeligheden, biodistributionen og effektiviteten af topisk administrerede stoffer, hvilket tyder på, at det måske ikke er den bedste kandidatbehandlingsrute for mange sygdomme i det indre øje. Lokal injektion i det specifikke okulære rum, der er ramt af sygdommen, vil sandsynligvis være en mere effektiv og målrettet lægemiddelafgivelsesmetode2. Imidlertid kan bivirkninger som følge af gentagne injektioner komplicere administrationsstrategier. Ideelt set bør en terapi opretholde langsigtet terapeutisk effekt efter en enkelt administration. Genterapi er således en lovende mulighed for at minimere antallet af nødvendige injektioner og tilvejebringe vedvarende transgenekspression til behandling af okulær sygdom 3,4.
Talrige virale og ikke-virale vektorer er tilgængelige til genterapi; AAV-vektorer er dog af stor interesse på grund af deres fremragende sikkerhedsprofil. AAV er en lille, enkeltstrenget, ikke-indhyllet DNA-virus, der oprindeligt blev opdaget som en forurening af et adenoviruspræparat i 1965 af Atchison et al.5,6 AAV blev efterfølgende konstrueret som en effektiv viral vektor til genlevering i 1980’erne og er blevet den valgte genterapivektor for mange sygdomme, herunder okulære lidelser, i løbet af de sidste par årtier. Den mest bemærkelsesværdige af disse er det første kommercielt tilgængelige genterapilægemiddel, voretigene neparvovec, som blev godkendt af USA’s Food and Drug Administration til behandling af Lebers medfødte amaurose, en sjælden bageste øjensygdom. Selvom voretigene neparvovec med succes har overvundet barrierer for klinisk udvikling, er der stadig udfordringer for kommercialisering af yderligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til patienter, der bevarer levedygtige retinale celler via subretinal injektion. Således er patienter med mere avancerede former for sygdommen, der mangler levedygtige retinale celler, ikke berettiget til behandling, da det ikke ville give nogen klinisk fordel. Derudover blev der observeret kendte komplikationer forbundet med subretinal injektionsproceduren, herunder øjenbetændelse, grå stær, retinal rive, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer i forbindelse med denne procedure omfatter muligheden for blødning, retinal løsrivelse, endophthalmitis og tilbagekaldelse af den okulære immun privilegerede status gennem øjenvævsdestruktion 9,10,11,12. Således er bestræbelser på at udforske mindre invasive genleveringsruter såsom SCJ-injektion blevet stadig vigtigere 13,14,15,16,17.
Bindehinden er en tynd membran, der indeholder 3-5 lag celler og forbinder det forreste øje med det indre øjenlåg. SCJ-injektioner anvendes klinisk til oftalmisk lægemiddelafgivelse til både de forreste og / eller bageste segmenter af øjet til behandling af okulære sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration, glaukom, retinitis og posterior uveitis18,19. De er relativt enkle at udføre, anvendes rutinemæssigt til oftalmisk lægemiddelafgivelse i en ambulant indstilling20, noget smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium og tillader administrerede lægemidler at sprede sig gennem en stor periorbital region, der omfatter synsnerven. Derfor er SCJ-injektioner en attraktiv administrationsvej for AAV-genterapiapplikationer. Naturlige AAV-serotyper administreret via SCJ-injektion i mus har tidligere været karakteriseret for sikkerhed, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution og vævsspecificitet13,16,21. Disse data viste, at genlevering til individuelle okulære væv via SCJ-administration er en formel mulighed.
Dette papir beskriver en enkel og tilpasningsdygtig protokol til SCJ-injektion til at levere AAV-vektorer i en musemodel. For at sikre, at denne fremgangsmåde kan reproduceres, beskrives et injektionssystem bestående af et stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som muliggør ensartet og præcis injektionshastighed og -tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette system kan tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Derudover bruges et fluoresceinfarvestof ofte til at muliggøre visualisering af AAV-injektionsstedet. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Endelig vil fælles valideringsteknikker til bekræftelse af AAV-levering til det ønskede væv kort blive diskuteret.
AAV-medieret genterapi rummer et stort potentiale for behandling af øjensygdomme. Den nuværende okulære genterapi er afhængig af to store lokale administrationsveje, intravitreale og subretinale injektioner. Desværre er begge ruter invasive og kan forårsage alvorlige komplikationer, herunder nethindeløsning, dannelse af grå stær og endophthalmitis. Således er undersøgelsen af relativt mindre invasive ruter, såsom SCJ-injektion, af stor interesse.
Selvom denne teknik er relativt lig…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for at levere scAAV8-GFP-vektorerne, der blev brugt i denne undersøgelse, CGIBD Histology Core og laboratoriet hos Dr. Brian C. Gilger for deres hjælp med de kliniske vurderingsaspekter af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereudviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.
36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
India ink | StatLab | NC9903975 | |
Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
Rebound tonometer | Tonovet | / | |
Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |