छोटे पशु मॉडल में एडेनो से जुड़े वायरस वैक्टर का उप-संयोजन प्रशासन
Summary
इस पांडुलिपि में, सबकॉन्जक्टिवल इंजेक्शन को चूहों में ओकुलर ऊतकों के लिए एक वैध वेक्टर डिलीवरी विधि के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें एक इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग किया जाता है जिसमें एक जलसेक / वापसी सिरिंज पंप और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज शामिल है। यह इंजेक्शन प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों के लिए भी अनुकूलनीय है।
Abstract
नेत्र रोगों में विरासत में मिले आनुवंशिक और अधिग्रहित विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है जो कई प्रशासन मार्गों के माध्यम से पहुंच की सापेक्ष आसानी के कारण स्थानीय दवा वितरण के लिए आकर्षक लक्ष्य हैं। सबकॉन्जंक्टिवल (एससीजे) इंजेक्शन अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों पर फायदे प्रदान करते हैं क्योंकि वे सरल, सुरक्षित होते हैं, और आमतौर पर बाह्य रोगी सेटिंग में किए जाते हैं। छोटे जानवरों में एससीजे इंजेक्शन को आमतौर पर आंख के आकार के कारण एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप की सहायता की आवश्यकता होती है। पिछले काम से पता चला है कि विशिष्ट एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) सीरोटाइप का एससीजे इंजेक्शन ओकुलर सतह, आंखों की मांसपेशियों, कॉर्निया और ऑप्टिक तंत्रिका के लक्षित पारगमन के लिए एक वैध जीन वितरण रणनीति है, जो कई ओकुलर रोगों के उपचार के लिए एक संभावित दृष्टिकोण प्रदान करता है।
यहां, एक माउस मॉडल में एससीजे इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें एक प्रोग्राम करने योग्य जलसेक / वापसी सिरिंज पंप (जो लगातार और सटीक इंजेक्शन गति और दबाव की अनुमति देता है) और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज शामिल है। इंजेक्शन प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों जैसे इंट्रास्ट्रोमल, इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और छोटे जानवरों में सबरेटिनल इंजेक्शन के लिए भी अनुकूलनीय है। यद्यपि ओकुलर जीन थेरेपी अध्ययनों के लिए एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर के वितरण का वर्णन किया गया है, यहां प्रोटोकॉल को छोटे पशु मॉडल में विभिन्न प्रकार के नेत्र समाधानों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। प्रशासन मार्ग में प्रमुख व्यावहारिक कदम, इंजेक्शन प्लेटफॉर्म के लिए सेटअप, इंजेक्शन की तैयारी, और प्रत्यक्ष अनुभव से युक्तियों पर विस्तार से चर्चा की जाएगी। इसके अलावा, वांछित ऊतकों को एएवी वितरण की पुष्टि के लिए सामान्य सत्यापन तकनीकों पर भी संक्षेप में चर्चा की जाएगी।
Introduction
नेत्र रोगों में आनुवंशिक और अधिग्रहित दोनों विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। 2015 में, अनुमानित 36 मिलियन लोग दुनिया भर में कानूनी रूप से अंधे थे, और 1 बिलियन से अधिक लोग कम से कम कुछ स्तर की दृश्य हानि से पीड़ित हैं, जो सभीस्तरों पर उन्मूलन प्रयासों को बढ़ाने की आवश्यकता पर प्रकाश डालते हैं। ओकुलर दवाओं को वितरित करने के मुख्य तरीकों में सामयिक और स्थानीय प्रशासन दोनों शामिल हैं, जैसे कि आई ड्रॉप या सबकॉन्जंक्टिवल (एससीजे), इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और सबरेटिनल इंजेक्शन। यद्यपि नॉनइनवेसिव सामयिक चिकित्सा नेत्र दवाओं के लिए सबसे आम वितरण विधि है और कई पूर्ववर्ती खंड विकारों के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग की जाती है, कॉर्नियल शारीरिक बाधाओं की उपस्थिति शीर्ष रूप से प्रशासित पदार्थों की जैव उपलब्धता, जैव वितरण और प्रभावकारिता के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है, यह सुझाव देते हुए कि यह आंतरिक आंखों के कई रोगों के लिए सबसे अच्छा उम्मीदवार उपचार मार्ग नहीं हो सकता है। रोग से प्रभावित विशिष्ट ओकुलर डिब्बे में स्थानीय इंजेक्शन एक अधिक प्रभावी और लक्षित दवावितरण दृष्टिकोण होने की संभावना है। हालांकि, बार-बार इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्रतिकूल प्रभाव प्रशासन रणनीतियों को जटिल कर सकते हैं। आदर्श रूप से, एक चिकित्सा को एकल प्रशासन के बाद दीर्घकालिक चिकित्सीय प्रभावकारिता बनाए रखनी चाहिए। इस प्रकार, जीन थेरेपी आवश्यक इंजेक्शन की संख्या को कम करने और ओकुलर रोग 3,4 के उपचार के लिए निरंतर ट्रांसजीन अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए एक आशाजनक विकल्प है।
जीन थेरेपी के लिए कई वायरल और नॉनवायरल वैक्टर उपलब्ध हैं; हालांकि, एएवी वैक्टर अपने उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफ़ाइल के कारण उच्च रुचि रखते हैं। एएवी एक छोटा, एकल-फंसे हुए, गैर-आवरण वाला डीएनए वायरस है जिसे शुरू में 1965 में एटचिसन एट अल द्वारा एडेनोवायरस तैयारी के संदूषक के रूप में खोजा गया था। पिछले कुछ दशकों में। इनमें से सबसे उल्लेखनीय पहली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीन थेरेपी दवा है, वोरेटिजीन नेपार्वोवेक, जिसे यूनाइटेड स्टेट्स फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन द्वारा लेबर के जन्मजात अमौरोसिस, एक दुर्लभ पश्चवर्ती आंख की बीमारी के इलाज के लिए अनुमोदित किया गया था। यद्यपि वोरेटिजीन नेपार्वोवेक ने नैदानिक विकास के लिए बाधाओं को सफलतापूर्वक दूर कर लिया है, अतिरिक्त ओकुलर जीन थेरेपी के व्यावसायीकरण के लिए चुनौतियां बनी हुई हैं। उदाहरण के लिए, वोरेटिजीन नेपार्वोवेक उन रोगियों को प्रशासित किया जाता है जो सबरेटिनल इंजेक्शन के माध्यम से व्यवहार्य रेटिना कोशिकाओं को बनाए रखते हैं। इस प्रकार, रोग के अधिक उन्नत रूपों वाले रोगी जिनके पास व्यवहार्य रेटिना कोशिकाओं की कमी होती है, वे उपचार के लिए पात्र नहीं होते हैं, क्योंकि यह कोई नैदानिक लाभ प्रदान नहीं करेगा। इसके अलावा, सबरेटिनल इंजेक्शन प्रक्रिया से जुड़ी ज्ञात जटिलताओं को देखा गया, जिसमें आंखों की सूजन, मोतियाबिंद, रेटिना फाड़, मैकुलोपैथी और दर्द 7,8 शामिल हैं। इस प्रक्रिया से संबंधित अन्य चिंताओं में रक्तस्राव, रेटिना डिटेचमेंट, एंडोफथाल्मिटिस, और आंखों के ऊतक विनाश के माध्यम से ओकुलर प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त स्थिति का निरसन 9,10,11,12 शामिल है। इस प्रकार, एससीजे इंजेक्शन जैसे कम आक्रामक जीन वितरण मार्गों का पता लगाने के प्रयास तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं 13,14,15,16,17।
नेत्रश्लेष्मला एक पतली झिल्ली है जिसमें कोशिकाओं की 3-5 परतें होती हैं और पूर्ववर्ती आंख को आंतरिक पलक से जोड़ती हैं। एससीजे इंजेक्शन का उपयोग नेत्र संबंधी रोगों जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन, ग्लूकोमा, रेटिनाइटिस और पश्चवर्ती यूवाइटिस18,19 के उपचार के लिए आंख के पूर्ववर्ती और / या पीछे के दोनों खंडों में नेत्र दवा वितरण के लिए चिकित्सकीय रूप से किया जाता है। वे प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल हैं, बाह्य रोगी सेटिंग20 में नेत्र दवा वितरण के लिए नियमित रूप से नियोजित, कुछ हद तक दर्द रहित, ओकुलर प्रतिरक्षा विशेषाधिकार से समझौता नहीं करते हैं, और प्रशासित दवाओं को एक बड़े पेरिऑर्बिटल क्षेत्र के माध्यम से फैलने की अनुमति देते हैं जिसमें ऑप्टिक तंत्रिका शामिल है। इसलिए, एससीजे इंजेक्शन एएवी जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए प्रशासन का एक आकर्षक मार्ग है। चूहों में एससीजे इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित प्राकृतिक एएवी सीरोटाइप को पहले सुरक्षा, पारगमन दक्षता, सीरम इम्युनोजेनेसिटी, जैव वितरण और ऊतक विशिष्टता 13,16,21 के लिए विशेषता दी गई है। इन आंकड़ों से पता चला है कि एससीजे प्रशासन के माध्यम से व्यक्तिगत ओकुलर ऊतकों को जीन वितरण एक औपचारिक संभावना है।
यह पेपर माउस मॉडल में एएवी वैक्टर देने के लिए एससीजे इंजेक्शन के लिए एक सरल और अनुकूलनीय प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, एक इंजेक्शन प्रणाली जिसमें एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, एक प्रोग्रामेबल इन्फ्यूजन / वापसी सिरिंज पंप (जो लगातार और सटीक इंजेक्शन गति और दबाव की अनुमति देता है), और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों के साथ युग्मित एक गैसटाइट हटाने योग्य सिरिंज का वर्णन किया गया है। यह प्रणाली अन्य इंट्राओकुलर प्रशासन मार्गों जैसे इंट्रास्ट्रोमल, इंट्राकैमरल, इंट्राविट्रल और छोटे जानवरों में सबरेटिनल इंजेक्शन के लिए अनुकूलनीय है। इसके अलावा, एएवी इंजेक्शन साइट के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए अक्सर एक फ्लोरेसिन डाई का उपयोग किया जाता है। प्रशासन मार्ग में प्रमुख व्यावहारिक कदम, इंजेक्शन प्लेटफॉर्म के लिए सेटअप, इंजेक्शन की तैयारी, और प्रत्यक्ष अनुभव से युक्तियों पर विस्तार से चर्चा की जाएगी। अंत में, वांछित ऊतकों को एएवी वितरण की पुष्टि के लिए सामान्य सत्यापन तकनीकों पर संक्षेप में चर्चा की जाएगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी ओकुलर रोगों के उपचार के लिए बहुत क्षमता रखती है। वर्तमान ओकुलर जीन थेरेपी दो प्रमुख स्थानीय प्रशासन मार्गों, इंट्राविट्रल और सबरेटिनल इंजेक्शन पर निर्भर करती है। दुर्भाग्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एससीएएवी 8-जीएफपी वैक्टर प्रदान करने के लिए उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में वेक्टर कोर, सीजीआईबीडी हिस्टोलॉजी कोर और इस अध्ययन के नैदानिक मूल्यांकन पहलुओं के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ ब्रायन सी गिलगर की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को फाइजर-एनसी बायोटेक डिस्टिंग्विश्ड पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप और अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी और सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन से कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि अमेरिकन सोसाइटी ऑफ जीन एंड सेल थेरेपी या सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे।
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch’s layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
