Subkonjunktiv administrering av adenoassosierte virusvektorer i små dyremodeller

Summary

I dette manuskriptet er subkonjunktival injeksjon vist som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært vev hos mus ved bruk av et injeksjonssystem bestående av en infusjons-/uttakssprøytepumpe og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette injeksjonssystemet kan også tilpasses andre intraokulære administrasjonsveier.

Abstract

Okulære sykdommer inkluderer et bredt spekter av arvelige genetiske og ervervede lidelser som er tiltalende mål for lokal legemiddellevering på grunn av deres relativt enkle tilgjengelighet via flere administrasjonsveier. Subkonjunktival (SCJ) injeksjoner gir fordeler i forhold til andre intraokulære administrasjonsveier, da de er enkle, trygge og vanligvis utføres i poliklinisk innstilling. SCJ-injeksjoner hos små dyr krever vanligvis hjelp fra et operasjonsmikroskop på grunn av øyets størrelse. Tidligere arbeid har vist at SCJ-injeksjon av spesifikke adeno-assosierte virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi for målrettet transduksjon av okulær overflate, øyemuskel, hornhinnen og optisk nerve, noe som gir en potensiell tilnærming til behandling av mange okulære sykdommer.

Her presenteres en detaljert protokoll for SCJ-injeksjoner i en musemodell ved hjelp av et injeksjonssystem som består av en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Injeksjonssystemet er også tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. Selv om levering av adenoassosierte virale vektorer for okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen her også tilpasses for en rekke oftalmiske løsninger i små dyremodeller. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. I tillegg vil vanlige valideringsteknikker for AAV-leveringsbekreftelse til ønsket vev også bli kort diskutert.

Introduction

Okulære sykdommer omfatter et bredt spekter av både genetiske og ervervede lidelser. I 2015 var anslagsvis 36 millioner mennesker juridisk blinde over hele verden, og over 1 milliard mennesker lider av minst et visst nivå av synshemming, noe som understreker behovet for å oppskalere lindringsarbeidet på alle nivåer¹. De viktigste metodene for å levere okulære medisiner inkluderer både lokal og lokal administrasjon, for eksempel øyedråper eller subkonjunktival (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner. Selv om ikke-invasiv topisk terapi er den vanligste leveringsmetoden for oftalmiske legemidler og er mye brukt for mange fremre segmentforstyrrelser, gir tilstedeværelsen av hornhindeanatomiske barrierer en utfordring for biotilgjengelighet, biodistribusjon og effekt av lokalt administrerte stoffer, noe som tyder på at det kanskje ikke er den beste kandidatbehandlingsruten for mange sykdommer i det indre øyet. Lokal injeksjon i det spesifikke okulære rommet som er berørt av sykdommen, vil sannsynligvis være en mer effektiv og^{målrettet tilnærming til} legemiddellevering. Bivirkninger som følge av gjentatte injeksjoner kan imidlertid komplisere administrasjonsstrategier. Ideelt sett bør en behandling opprettholde langsiktig terapeutisk effekt etter en enkelt administrering. Dermed er genterapi et lovende alternativ for å minimere antall nødvendige injeksjoner og gi vedvarende transgenuttrykk for behandling av okulær sykdom ^3,4.

Tallrike virale og ikke-virale vektorer er tilgjengelige for genterapi; AAV-vektorer er imidlertid av stor interesse på grunn av deres utmerkede sikkerhetsprofil. AAV er et lite, enkeltstrenget, ikke-innhyllet DNA-virus som opprinnelig ble oppdaget som en forurensning av et adenoviruspreparat i 1965 av Atchison et ^al.5,6 AAV ble senere konstruert som en effektiv virusvektor for genlevering på 1980-tallet og har blitt den foretrukne genterapivektoren for mange sykdommer, inkludert okulære lidelser^, i løpet av de siste tiårene. Den mest bemerkelsesverdige av disse er det første kommersielt tilgjengelige genterapimedikamentet, voretigene neparvovec, som ble godkjent av USA Food and Drug Administration for å behandle Lebers medfødte amaurose, en sjelden bakre øyesykdom. Selv om voretigene neparvovec har lykkes med å overvinne barrierer for klinisk utvikling, gjenstår utfordringer for kommersialisering av ytterligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til pasienter som beholder levedyktige retinale celler via subretinal injeksjon. Dermed er pasienter med mer avanserte former for sykdommen som mangler levedyktige retinale celler, ikke kvalifisert for behandling, da det ikke ville gi noen klinisk fordel. I tillegg ble det observert kjente komplikasjoner forbundet med subretinal injeksjonsprosedyre, inkludert øyebetennelse, grå stær, retinal tåre, makulopati og smerte ^7,8. Andre bekymringer knyttet til denne prosedyren inkluderer muligheten for blødning, retinal detachment, endofthalmitis og tilbakekalling av okulær immun privilegert status gjennom øyevev ødeleggelse 9,10,11,12. Dermed har innsatsen for å utforske mindre invasive genleveringsruter som SCJ-injeksjon blitt stadig viktigere 13,14,15,16,17.

Konjunktivene er en tynn membran som inneholder 3-5 lag med celler og forbinder det fremre øyet med det indre øyelokket. SCJ-injeksjoner brukes klinisk for oftalmisk legemiddellevering til både fremre og / eller bakre segmenter av øyet for behandling av okulære sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon, glaukom, retinitt og bakre uveitt^18,19. De er relativt enkle å utføre, brukes rutinemessig for oftalmisk legemiddellevering i en poliklinisk innstilling²⁰, noe smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium, og tillater administrerte legemidler å spre seg gjennom en stor periorbital region som omfatter optisk nerve. Derfor er SCJ-injeksjoner en attraktiv administrasjonsmåte for AAV-genterapiapplikasjoner. Naturlige AAV-serotyper administrert via SCJ-injeksjon hos mus har tidligere blitt karakterisert for sikkerhet, transduksjonseffektivitet, serumimmunogenisitet, biodistribusjon og vevsspesifisitet^13,16,21. Disse dataene viste at genlevering til individuelle okulære vev via SCJ-administrasjon er en formell mulighet.

Denne rapporten beskriver en enkel og tilpasningsdyktig protokoll for SCJ-injeksjon for å levere AAV-vektorer i en musemodell. For å sikre reproduserbarheten av denne tilnærmingen beskrives et injeksjonssystem som består av et stereomikroskop, en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette systemet er tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. I tillegg brukes ofte et fluoresceinfargestoff for å tillate visualisering av AAV-injeksjonsstedet. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. Til slutt vil vanlige valideringsteknikker for bekreftelse av AAV-levering til ønsket vev bli kort diskutert.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med forskriftene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Carolina på Chapel Hill. Bruken av AAV-vektorer er en biohazard risiko for biosikkerhet nivå 1. Bruk riktig personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk, hansker og vernebriller ved håndtering av AAV. For eksperimentet som er beskrevet her, ble en rekombinant AAV-vektor pakket med serotype 8-kapsiden og koding av en generisk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor som kon…

Representative Results

Oppløsning injisert i subkonjunktivalrommet presenterer som en bleb avhengig av injeksjonsvolumet.I dette eksperimentet ble 7 μL AAV (7 × 109 virale genomer (vg) / øye) blandet med fluorescein ved en endelig konsentrasjon på 0,1% injisert med en 36 G nål under et stereomikroskop, og injeksjonshastigheten / trykket ble holdt konstant ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe ved 1 μL / s. En bleb kan vises ved injeksjon (pil). En mikroskopisk oversikt over administrering av AAV-vek…

Discussion

AAV-mediert genterapi har et stort potensial for behandling av øyesykdommer. Nåværende okulær genterapi er avhengig av to store lokale administrasjonsveier, intravitreale og subretinale injeksjoner. Dessverre er begge rutene invasive og kan forårsake alvorlige komplikasjoner, inkludert retinal detachment, kataraktdannelse og endofthalmitis. Dermed er undersøkelsen av relativt mindre invasive ruter, som SCJ-injeksjon, av stor interesse.

Selv om denne teknikken er relativt enkel og betydel…

Materials

36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448