Subkonjunktival administration af adeno-associerede virusvektorer i smådyrsmodeller
Summary
I dette manuskript demonstreres subkonjunktival injektion som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært væv hos mus ved hjælp af et injektionssystem bestående af en infusions- / tilbagetrækningssprøjtepumpe og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette injektionssystem kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje.
Abstract
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af arvelige genetiske og erhvervede lidelser, der er tiltalende mål for lokal lægemiddellevering på grund af deres relative lette tilgængelighed via flere administrationsveje. Subkonjunktivale (SCJ) injektioner giver fordele i forhold til andre intraokulære administrationsveje, da de er enkle, sikre og normalt udføres i en ambulant indstilling. SCJ-injektioner i små dyr kræver normalt hjælp fra et operativt mikroskop på grund af øjets størrelse. Tidligere arbejde har vist, at SCJ-injektion af specifikke adeno-associerede virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi til målrettet transduktion af den okulære overflade, øjenmuskel, hornhinde og synsnerve, hvilket giver en potentiel tilgang til behandling af mange okulære sygdomme.
Heri præsenteres en detaljeret protokol for SCJ-injektioner i en musemodel ved hjælp af et injektionssystem bestående af en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som giver mulighed for ensartet og præcis injektionshastighed og tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Injektionssystemet kan også tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Selvom levering af adeno-associerede virale vektorer til okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen heri også tilpasses til en række oftalmiske opløsninger i smådyrsmodeller. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Derudover vil almindelige valideringsteknikker til AAV-leveringsbekræftelse til det ønskede væv også blive kort diskuteret.
Introduction
Okulære sygdomme omfatter en bred vifte af både genetiske og erhvervede lidelser. I 2015 var anslået 36 millioner mennesker juridisk blinde på verdensplan, og over 1 milliard mennesker lider af mindst en vis grad af synshandicap, hvilket understreger behovet for at opskalere lindringsindsatsen på alle niveauer1. De vigtigste metoder til levering af okulær medicin omfatter både topisk og lokal administration, såsom øjendråber eller subkonjunktivale (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner. Selvom ikke-invasiv topisk terapi er den mest almindelige leveringsmetode for oftalmiske lægemidler og i vid udstrækning anvendes til mange forreste segmentforstyrrelser, udgør tilstedeværelsen af hornhinde anatomiske barrierer en udfordring for biotilgængeligheden, biodistributionen og effektiviteten af topisk administrerede stoffer, hvilket tyder på, at det måske ikke er den bedste kandidatbehandlingsrute for mange sygdomme i det indre øje. Lokal injektion i det specifikke okulære rum, der er ramt af sygdommen, vil sandsynligvis være en mere effektiv og målrettet lægemiddelafgivelsesmetode2. Imidlertid kan bivirkninger som følge af gentagne injektioner komplicere administrationsstrategier. Ideelt set bør en terapi opretholde langsigtet terapeutisk effekt efter en enkelt administration. Genterapi er således en lovende mulighed for at minimere antallet af nødvendige injektioner og tilvejebringe vedvarende transgenekspression til behandling af okulær sygdom 3,4.
Talrige virale og ikke-virale vektorer er tilgængelige til genterapi; AAV-vektorer er dog af stor interesse på grund af deres fremragende sikkerhedsprofil. AAV er en lille, enkeltstrenget, ikke-indhyllet DNA-virus, der oprindeligt blev opdaget som en forurening af et adenoviruspræparat i 1965 af Atchison et al.5,6 AAV blev efterfølgende konstrueret som en effektiv viral vektor til genlevering i 1980’erne og er blevet den valgte genterapivektor for mange sygdomme, herunder okulære lidelser, i løbet af de sidste par årtier. Den mest bemærkelsesværdige af disse er det første kommercielt tilgængelige genterapilægemiddel, voretigene neparvovec, som blev godkendt af USA’s Food and Drug Administration til behandling af Lebers medfødte amaurose, en sjælden bageste øjensygdom. Selvom voretigene neparvovec med succes har overvundet barrierer for klinisk udvikling, er der stadig udfordringer for kommercialisering af yderligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til patienter, der bevarer levedygtige retinale celler via subretinal injektion. Således er patienter med mere avancerede former for sygdommen, der mangler levedygtige retinale celler, ikke berettiget til behandling, da det ikke ville give nogen klinisk fordel. Derudover blev der observeret kendte komplikationer forbundet med subretinal injektionsproceduren, herunder øjenbetændelse, grå stær, retinal rive, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer i forbindelse med denne procedure omfatter muligheden for blødning, retinal løsrivelse, endophthalmitis og tilbagekaldelse af den okulære immun privilegerede status gennem øjenvævsdestruktion 9,10,11,12. Således er bestræbelser på at udforske mindre invasive genleveringsruter såsom SCJ-injektion blevet stadig vigtigere 13,14,15,16,17.
Bindehinden er en tynd membran, der indeholder 3-5 lag celler og forbinder det forreste øje med det indre øjenlåg. SCJ-injektioner anvendes klinisk til oftalmisk lægemiddelafgivelse til både de forreste og / eller bageste segmenter af øjet til behandling af okulære sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration, glaukom, retinitis og posterior uveitis18,19. De er relativt enkle at udføre, anvendes rutinemæssigt til oftalmisk lægemiddelafgivelse i en ambulant indstilling20, noget smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium og tillader administrerede lægemidler at sprede sig gennem en stor periorbital region, der omfatter synsnerven. Derfor er SCJ-injektioner en attraktiv administrationsvej for AAV-genterapiapplikationer. Naturlige AAV-serotyper administreret via SCJ-injektion i mus har tidligere været karakteriseret for sikkerhed, transduktionseffektivitet, serumimmunogenicitet, biodistribution og vævsspecificitet13,16,21. Disse data viste, at genlevering til individuelle okulære væv via SCJ-administration er en formel mulighed.
Dette papir beskriver en enkel og tilpasningsdygtig protokol til SCJ-injektion til at levere AAV-vektorer i en musemodel. For at sikre, at denne fremgangsmåde kan reproduceres, beskrives et injektionssystem bestående af et stereomikroskop, en programmerbar infusions-/abstinenssprøjtepumpe (som muliggør ensartet og præcis injektionshastighed og -tryk) og en gastæt aftagelig sprøjte kombineret med mikroinjektionsnåle. Dette system kan tilpasses til andre intraokulære administrationsveje såsom intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injektioner hos små dyr. Derudover bruges et fluoresceinfarvestof ofte til at muliggøre visualisering af AAV-injektionsstedet. De vigtigste praktiske trin i administrationsvejen, opsætningen af injektionsplatformen, forberedelsen af injektionen og tip fra direkte erfaring vil blive diskuteret detaljeret. Endelig vil fælles valideringsteknikker til bekræftelse af AAV-levering til det ønskede væv kort blive diskuteret.
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV-medieret genterapi rummer et stort potentiale for behandling af øjensygdomme. Den nuværende okulære genterapi er afhængig af to store lokale administrationsveje, intravitreale og subretinale injektioner. Desværre er begge ruter invasive og kan forårsage alvorlige komplikationer, herunder nethindeløsning, dannelse af grå stær og endophthalmitis. Således er undersøgelsen af relativt mindre invasive ruter, såsom SCJ-injektion, af stor interesse.
Selvom denne teknik er relativt lig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for at levere scAAV8-GFP-vektorerne, der blev brugt i denne undersøgelse, CGIBD Histology Core og laboratoriet hos Dr. Brian C. Gilger for deres hjælp med de kliniske vurderingsaspekter af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereudviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-associated defective virus particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K. Ocular drug delivery. AAPS Journal. 12 (3), 348-360 (2010).
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S. Administering a subconjunctival injection. Community Eye Health. 22 (69), 15 (2009).
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch’s layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
