Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans
Summary
Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.
Abstract
Die invasive Candida albicans-Infektion ist eine signifikante opportunistische Pilzinfektion beim Menschen, da sie einer der häufigsten Kolonisatoren von Darm, Mund, Vagina und Haut ist. Trotz der Verfügbarkeit von antimykotischen Medikamenten bleibt die Sterblichkeitsrate der invasiven Candidiasis ~ 50%. Leider nimmt die Inzidenz von arzneimittelresistenten C. albicans weltweit zu. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine alternative oder adjuvante Behandlung bieten, um die Bildung von C. albicans-Biofilmen zu hemmen und Arzneimittelresistenzen zu überwinden. Rose bengal (RB) vermittelte aPDT hat eine effektive Zellabtötung von Bakterien und C. albicans gezeigt. In dieser Studie wird die Wirksamkeit von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans beschrieben. Eine hausgemachte grüne Leuchtdioden-Lichtquelle (LED) ist so konzipiert, dass sie sich an der Mitte einer Vertiefung einer 96-Well-Platte ausrichtet. Die Hefen wurden in den Brunnen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RB inkubiert und mit unterschiedlichen Grünlichtfluanzen beleuchtet. Die Tötungseffekte wurden mit der Plattenverdünnungsmethode analysiert. Mit einer optimalen Kombination von Licht und RB wurde eine 3-log-Wachstumshemmung erreicht. Es wurde der Schluss gezogen, dass RB-aPDT möglicherweise arzneimittelresistente C. albicans hemmen könnte.
Introduction
C. albicans besiedelt im Magen-Darm- und Urogenitaltrakt gesunder Personen und kann bei etwa 50 Prozent der Individuen als normale Mikrobiota nachgewiesen werden1. Wenn ein Ungleichgewicht zwischen dem Wirt und dem Erreger entsteht, ist C. albicans in der Lage, einzudringen und Krankheiten zu verursachen. Die Infektion kann von lokalen Schleimhautinfektionen bis hin zu multiplem Organversagenreichen 2. In einer multizentrischen Surveillance-Studie in den USA ist etwa die Hälfte der Isolate von Patienten mit invasiver Candidiasis zwischen 2009 und 2017 C. albicans3. Candidämie kann mit hohen Morbiditätsraten, Mortalität, längerem Krankenhausaufenthaltverbunden sein 4. Die US-amerikanischen Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention berichteten, dass etwa 7% aller getesteten Candida-Blutproben gegen das AntimykotikumFluconazol 5 resistent sind. Das Auftreten arzneimittelresistenter Candida-Spezies wirft die Sorge auf, eine alternative oder adjuvante Therapie zu Antimykotika zu entwickeln.
Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) wird ein spezifischer Photosensibilisator (PS) mit Licht auf der maximalen Absorptionswellenlänge des PS6 aktiviert. Nach der Anregung überträgt das angeregte PS seine Energie oder Elektronen auf die nahe gelegenen Sauerstoffmoleküle und kehrt in den Grundzustand zurück. Während dieses Prozesses bilden sich reaktive Sauerstoffspezies und Singulett-Sauerstoff, die Zellschäden verursachen. aPDT wird seit den 1990er Jahren häufig zur Abtötung von Mikroorganismeneingesetzt 7. Einer der Vorteile von aPDT besteht darin, dass mehrere Organellen in einer Zelle durch Singulett-Sauerstoff und / oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) während der Bestrahlung beschädigt werden; Daher wurde bis heute kein Widerstand gegen aPDT gefunden. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die Bakterien, die nach der aPDT überlebten, empfindlicher auf Antibiotikareagierten 8.
Zu den in aPDT verwendeten Lichtquellen gehören Laser, Metallhalogenlampen mit Filtern, Nahinfrarotlicht und Leuchtdioden (LED) 9,10,11,12. Der Laser liefert eine hohe Lichtleistung, in der Regel größer als 0,5 W/cm2, die die Abgabe einer hohen Lichtdosis in sehr kurzer Zeit ermöglicht. Es wurde häufig in Fällen verwendet, in denen eine längere Behandlungszeit unbequem ist, wie z.B. aPDT für orale Infektionen. Der Nachteil eines Lasers ist, dass seine Spotgröße der Beleuchtung klein ist und von einigen hundert Mikrometern bis 10 mm mit einem Diffusor reicht. Darüber hinaus sind Lasergeräte teuer und erfordern eine spezielle Schulung für die Bedienung. Auf der anderen Seite ist die Bestrahlungsfläche einer Metallhalogenlampe mit Filtern relativ groß13. Allerdings ist die Lampe zu kräftig und teuer. LED-Lichtquellen sind im dermatologischen Bereich zum Mainstream der aPDT geworden, da sie klein und kostengünstiger sind. Die Bestrahlungsfläche kann bei einer Anordnung der LED-Glühbirne relativ groß sein. Das ganze Gesicht kann gleichzeitig beleuchtetwerden 9. Dennoch sind die meisten, wenn nicht alle, heute verfügbaren LED-Lichtquellen für den klinischen Einsatz konzipiert. Es ist möglicherweise nicht für Experimente in einem Labor geeignet, da es platzraubend und teuer ist. Wir haben ein preiswertes LED-Array entwickelt, das sehr klein ist und aus einem LED-Streifen geschnitten und montiert werden kann. Die LEDs können in verschiedene Anordnungen für unterschiedliche Versuchsdesigns eingebaut werden. Verschiedene Bedingungen der aPDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment abgeschlossen werden.
Rose Bengal (RB) ist ein farbiger Farbstoff, der häufig verwendet wird, um die Visualisierung von Hornhautschäden in menschlichen Augen zu verbessern14. RB-vermittelte aPDT hat abtötende Wirkungen auf Staphylococcus aureus, Escherichia coli und C. albicans mit einer in etwa vergleichbaren Effizienz wie bei ToluidinblauO 15 gezeigt. Diese Studie zeigt eine Methode zur Validierung der Wirkung von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ermutigende Ergebnisse der klinischen Anwendungen von RB-PDT bei Pilzkeratitis wurden kürzlichberichtet 19. Der Absorptionspeak von RB liegt bei 450-650 nm. Es ist wichtig, die Fluenzrate der Lichtquelle für eine erfolgreiche aPDT zu bestimmen. Eine hohe Fluenz (normalerweise >100 J / cm2) ist erforderlich, um Krebszellen zu behandeln, während eine niedrigere Fluenz zur Behandlung infizierter Läsionen6 erwartet wird. Eine hohe Fluenz bedeutet eine lange Expos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Center of Applied Nanomedicine, der National Cheng Kung University vom Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project vom Bildungsministerium (MOE) und vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] an TW Wong finanziert. J.H. Hung erkennt die Finanzierung durch das National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], und [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] an.
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
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