로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해
Summary
약물 내성 칸디다 알비 칸스의 발생률이 증가하는 것은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 항균 광역학 요법 (aPDT)은 약물 내성 곰팡이 감염에 맞서 싸울 수있는 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 시험관내에서 다약제 내성 C. 알비칸 균주에 대한 로즈벵골 매개 aPDT 효능을 기술한다.
Abstract
침습성 칸디다 알비칸스 감염은 장, 입, 질 및 피부의 가장 흔한 식민지 개척자 중 하나이기 때문에 인간에서 중요한 기회 주의적 곰팡이 감염입니다. 항진균제의 가용성에도 불구하고, 침습성 칸디다증의 사망률은 ~ 50 %로 남아 있습니다. 불행히도, 약물 내성 C. 알비칸의 발생률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 C. 알비칸 생물막 형성을 억제하고 약물 내성을 극복하기 위한 대안 또는 보조제 치료를 제공할 수 있다. 로즈벵골(RB)-매개 aPDT는 박테리아 및 C. 알비칸의 효과적인 세포 사멸을 보여주었다. 이 연구에서, 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효능이 기재되어 있다. 수제 녹색 발광 다이오드(LED) 광원은 96웰 플레이트의 웰 중앙에 정렬되도록 설계되었습니다. 효모는 상이한 농도의 RB를 갖는 웰에서 배양되었고, 녹색 빛의 다양한 플루언스로 조명되었다. 사멸 효과를 플레이트 희석 방법에 의해 분석하였다. 빛과 RB의 최적 조합으로, 3-로그 성장 억제가 달성되었다. RB-aPDT가 잠재적으로 약물 내성 C. 알비칸을 억제 할 수 있다고 결론지었다.
Introduction
C. 알비칸은 건강한 개인의 위장관 및 비뇨 생식기에서 식민지화되며 개인의 약 50 %에서 정상적인 미생물로 검출 될 수 있습니다1. 숙주와 병원체 사이에 불균형이 생기면 C. albicans 는 침입하여 질병을 일으킬 수 있습니다. 감염은 국소 점막 감염에서 다발성 장기 부전까지 다양 할 수 있습니다2. 미국의 다중 센터 감시 연구에서 2009 년과 2017 년 사이에 침습성 칸디다증 환자로부터 격리 된 환자의 약 절반이 C. albicans3입니다. 칸디다혈증은 높은 이환율, 사망률, 장기간 입원4와 연관될 수 있다. 미국 질병 통제 예방 센터 (US Centers of Disease Control and Prevention)는 검사 된 모든 칸디다 혈액 샘플의 약 7 %가 항진균제 인 플루코나졸5에 내성이 있다고보고했습니다. 약물 내성 칸디다 종의 출현은 항균제에 대한 대안 또는 보조 요법을 개발하려는 우려를 제기합니다.
항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 PS6의 피크 흡수 파장에서 빛으로 특정 광감작제 (PS)를 활성화시키는 것을 포함한다. 여기 후, 흥분된 PS는 에너지 또는 전자를 근처의 산소 분자로 전달하고 바닥 상태로 되돌아갑니다. 이 과정에서 반응성 산소 종과 일중항 산소가 형성되어 세포 손상을 일으 킵니다. aPDT는 1990년대7일부터 미생물을 죽이기 위해 널리 사용되어 왔다. aPDT의 이점 중 하나는 조사 중에 단일 산소 및 / 또는 반응성 산소 종 (ROS)에 의해 세포에서 여러 소기관이 손상된다는 것입니다. 따라서 aPDT에 대한 저항은 오늘날까지 발견되지 않았습니다. 더욱이, 최근의 한 연구는 aPDT 이후에 생존한 박테리아가 항생제에 더 민감해졌다고 보고하였다8.
aPDT에 사용되는 광원에는 레이저, 필터가 있는 금속 할로겐 램프, 근적외선 및 발광 다이오드(LED)9,10,11,12가 포함됩니다. 레이저는 일반적으로 0.5W/cm2보다 큰 높은 광전력을 제공하므로 매우 짧은 시간에 높은 광량을 제공할 수 있습니다. 구강 감염에 대한 aPDT와 같이 치료 시간이 길어지는 경우에 널리 사용되고 있다. 레이저의 단점은 조명의 스폿 크기가 작으며 디퓨저를 사용하면 수백 마이크로 미터에서 10mm에 이릅니다. 또한 레이저 장비는 비용이 많이 들고 작동하려면 특정 교육이 필요합니다. 한편, 필터를 이용한 금속 할로겐 램프의 조사 면적은 상대적으로 크다(13). 그러나 램프가 너무 무겁고 비쌉니다. LED 광원은 작고 저렴하기 때문에 피부과 분야에서 aPDT의 주류가되었습니다. 조사 영역은 LED 전구의 어레이 배열로 비교적 클 수 있다. 얼굴 전체를 동시에 비출 수 있습니다9. 그럼에도 불구하고, 전부는 아닐지라도 오늘날 이용 가능한 대부분의 LED 광원은 임상 사용을 위해 설계되었습니다. 그것은 공간을 차지하고 비싸기 때문에 실험실에서의 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 우리는 매우 작고 LED 스트립에서 절단 및 조립 할 수있는 저렴한 LED 어레이를 개발했습니다. LED는 다양한 실험 설계를 위해 다양한 배열로 장착할 수 있습니다. aPDT의 상이한 조건은 하나의 실험에서 96-웰 플레이트 또는 심지어 384-웰 플레이트에서 완성될 수 있다.
로즈 벵골 (RB)은 인간의 눈에서 각막 손상의 시각화를 향상시키기 위해 널리 사용되는 컬러 염료입니다14. RB 매개 aPDT는 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리치아 콜리 및 C. 알비칸 에 대한 사멸 효과를 톨루이딘 블루O15의 것과 거의 유사한 효율로 나타냈다. 본 연구는 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효과를 검증하는 방법을 시연한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
곰팡이 각막염에 대한 RB-PDT의 임상 적용의 고무적인 결과가 최근19 보고되었다. RB의 흡수 피크는 450-650 nm에 있다. 성공적인 aPDT를 위해 광원의 플루언스 속도를 결정하는 것이 필수적입니다. 암세포를 치료하기 위해서는 높은 플루언스 (보통 >100 J /cm2)가 필요하지만 감염된 병변을 치료하기 위해서는 더 낮은 플루언스가 필요합니다6. 높은 플루언스는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 교육부 (MOE)의 고등 교육 새싹 프로젝트의 틀 내에서 특집 지역 연구 센터 프로그램으로부터 응용 나노 의학 센터, 국립 청 쿵 대학 (National Cheng Kung University)과 대만 과학 기술부 [MOST 109-2327-B-006-005]에서 TW Wong에 자금을 지원했습니다. J.H. Hung은 대만 국립 청 쿵 대학 병원 [NCKUH-11006018] 및 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3]의 자금을 인정합니다.
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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