Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans
Summary
A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.
Abstract
A infecção por cânbis invasivos é uma infecção fúngica oportunista significativa em humanos porque é um dos colonizadores mais comuns do intestino, boca, vagina e pele. Apesar da disponibilidade de medicamentos antifúngicos, a taxa de mortalidade por candidíase invasiva permanece ~50%. Infelizmente, a incidência de C. albicans resistentes a medicamentos está aumentando globalmente. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer um tratamento alternativo ou adjuvante para inibir a formação de biofilmes C. albicans e superar a resistência a medicamentos. Rose bengala (RB) mediada aPDT mostrou morte celular eficaz de bactérias e C. albicans. Neste estudo, descreve-se a eficácia do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes. Uma fonte de luz diodo verde caseira (LED) foi projetada para se alinhar com o centro de uma placa de 96 poços. As leveduras foram incubadas nos poços com diferentes concentrações de RB e iluminadas com fluências variadas de luz verde. Os efeitos da morte foram analisados pelo método de diluição da placa. Com uma combinação ideal de luz e RB, a inibição do crescimento de 3 log foi alcançada. Concluiu-se que o RB-aPDT poderia potencialmente inibir c. albicans resistentes a medicamentos.
Introduction
C. albicans coloniza nos tratos gastrointestinal e genitourinary de indivíduos saudáveis e pode ser detectado como microbiota normal em cerca de 50% dos indivíduos1. Se um desequilíbrio é criado entre o hospedeiro e o patógeno, os albicanos são capazes de invadir e causar doenças. A infecção pode variar de infecções locais de membrana mucosa a falência múltipla de órgãos2. Em um estudo de vigilância multicêntrico nos EUA, cerca de metade dos isolados de pacientes com candidíase invasiva entre 2009 e 2017 é C. albicans3. A candidemia pode estar associada a altas taxas de morbidade, mortalidade, internação prolongada4. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA relataram que cerca de 7% de todas as amostras de sangue candida testadas são resistentes ao fluconazol antifúngico5. O surgimento de espécies candidas resistentes a medicamentos levanta a preocupação de desenvolver uma terapia alternativa ou adjuvante para agentes antimícticos.
A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) envolve a ativação de um fotoensibilizador específico (PS) com luz no comprimento de onda de absorção máxima do PS6. Após a excitação, o PS animado transfere sua energia ou elétrons para as moléculas de oxigênio próximas e retorna ao estado terrestre. Durante esse processo, espécies reativas de oxigênio e oxigênio único são formadas e causam danos celulares. aPDT tem sido amplamente usada para matar microrganismos desde a década de 19907. Um dos benefícios do APDT é que várias organelas são danificadas em uma célula por espécies de oxigênio único e/ou reativa (ROS) durante a irradiação; assim, a resistência ao APDT não foi encontrada até hoje. Além disso, um estudo recente relatou que as bactérias que sobreviveram após o APDT tornaram-se mais sensíveis aos antibióticos8.
As fontes de luz utilizadas no APDT incluem lasers, lâmpadas halógenas metálicas com filtros, luz quase infravermelha e diodo emissor de luz (LED)9,10,11,12. O laser fornece uma alta potência de luz, geralmente maior que 0,5 W/cm2, que permite a entrega de uma dose de luz alta em um tempo muito curto. Tem sido amplamente utilizado em casos em que um tempo de tratamento mais longo é inconveniente, como o APDT para infecções bucais. A desvantagem de um laser é que seu tamanho de ponto de iluminação é pequeno, variando de algumas centenas de micrômetros a 10 mm com um difusor. Além disso, o equipamento a laser é caro e precisa de treinamento específico para operar. Por outro lado, a área de irradiação de uma lâmpada de halogênio metálico com filtros é relativamente maior13. No entanto, a lâmpada é muito pesada e cara. As fontes de luz LED tornaram-se comuns de aPDT no campo dermatológico porque é pequena e menos cara. A área de irradiação pode ser relativamente grande com um arranjo de matriz da lâmpada LED. O rosto inteiro pode ser iluminado ao mesmo tempo9. No entanto, a maioria, se não todas, as fontes de luz LED disponíveis hoje são projetadas para uso clínico. Pode não ser adequado para experimentos em laboratório porque é ocupando espaço e caro. Desenvolvemos uma matriz led barata que é muito pequena e pode ser cortada e montada a partir de uma tira led. Os LEDs podem ser instalados em diferentes arranjos para diferentes projetos experimentais. Diferentes condições de aPDT podem ser completadas em uma placa de 96 poços ou até mesmo em uma placa de 384 poços em um experimento.
Rose bengala (RB) é um corante colorido amplamente utilizado para melhorar a visualização de danos na córnea nos olhos humanos14. APDT mediada por RB mostrou efeitos de morte em Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans com eficiência aproximadamente comparável à do azul Toluidine O15. Este estudo demonstra um método para validar o efeito do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultados encorajadores das aplicações clínicas de RB-PDT para ceratite fúngica foram relatados recentemente19. O pico de absorção de RB é de 450-650 nm. É essencial determinar a taxa de fluência da fonte de luz para um aPDT bem sucedido. Uma alta fluência (geralmente >100 J/cm2) é necessária para tratar células cancerígenas, enquanto espera-se que uma fluência mais baixa trate lesões infectadas6. Uma alta fluência significa um longo tempo de ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho recebeu financiamento do Centro de Nanomedicina Aplicada, Universidade Nacional de Cheng Kung do Programa de Centro de Pesquisa de Áreas Destacadas no âmbito do Projeto Desafeito do Ensino Superior pelo Ministério da Educação (MOE), e do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] à TW Wong. J.H. Hung reconhece financiamento do National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], e [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
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