Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans
Summary
La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l’efficacia dell’aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.
Abstract
L’infezione invasiva da Candida albicans è una significativa infezione fungina opportunistica negli esseri umani perché è uno dei colonizzatori più comuni dell’intestino, della bocca, della vagina e della pelle. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, il tasso di mortalità della candidosi invasiva rimane ~ 50%. Sfortunatamente, l’incidenza di C. albicans resistente ai farmaci sta aumentando a livello globale. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire un trattamento alternativo o adiuvante per inibire la formazione di biofilm di C. albicans e superare la resistenza ai farmaci. L’aPDT mediato da Rose Bengal (RB) ha dimostrato un’efficace uccisione cellulare di batteri e C. albicans. In questo studio, viene descritta l’efficacia di RB-aPDT su C. albicans multiresistente ai farmaci. Una sorgente luminosa a diodi a emissione di luce verde (LED) fatta in casa è progettata per allinearsi con il centro di un pozzo di una piastra a 96 pozzetti. I lieviti sono stati incubati nei pozzetti con diverse concentrazioni di RB e illuminati con fluenze variabili di luce verde. Gli effetti di uccisione sono stati analizzati con il metodo di diluizione della piastra. Con una combinazione ottimale di luce e RB, è stata raggiunta l’inibizione della crescita a 3 log. Si è concluso che RB-aPDT potrebbe potenzialmente inibire C. albicans resistente ai farmaci.
Introduction
C. albicans colonizza nel tratto gastrointestinale e genito-urinario di individui sani e può essere rilevato come microbiota normale in circa il 50% degli individui1. Se si crea uno squilibrio tra l’ospite e l’agente patogeno, C. albicans è in grado di invadere e causare malattie. L’infezione può variare da infezioni locali della mucosa a insufficienza multiorgano2. In uno studio di sorveglianza multicentrico negli Stati Uniti, circa la metà degli isolati di pazienti con candidosi invasiva tra il 2009 e il 2017 è C. albicans3. La candidemia può essere associata ad alti tassi di morbilità, mortalità, degenza ospedaliera prolungata4. I Centri statunitensi di controllo e prevenzione delle malattie hanno riferito che circa il 7% di tutti i campioni di sangue di Candida testati sono resistenti al farmaco antifungino fluconazolo5. L’emergere di specie di Candida resistenti ai farmaci solleva la preoccupazione di sviluppare una terapia alternativa o adiuvante agli agenti antimicotici.
La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prevede l’attivazione di un fotosensibilizzante specifico (PS) con la luce alla lunghezza d’onda di assorbimento di picco del PS6. Dopo l’eccitazione, il PS eccitato trasferisce la sua energia o elettroni alle molecole di ossigeno vicine e ritorna allo stato fondamentale. Durante questo processo, si formano specie reattive dell’ossigeno e ossigeno singoletto che causano danni alle cellule. aPDT è stato ampiamente utilizzato per uccidere i microrganismi dal 19907. Uno dei vantaggi dell’aPDT è che più organelli sono danneggiati in una cellula dall’ossigeno singoletto e / o dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS) durante l’irradiazione; pertanto, la resistenza all’aPDT non è stata trovata fino ad oggi. Inoltre, un recente studio ha riportato che i batteri sopravvissuti dopo l’aPDT sono diventati più sensibili agli antibiotici8.
Le sorgenti luminose utilizzate in aPDT includono laser, lampade alogene metalliche con filtri, luce nel vicino infrarosso e diodi emettitori di luce (LED)9,10,11,12. Il laser fornisce un’elevata potenza luminosa, solitamente superiore a 0,5 W/cm2, che consente l’erogazione di una dose di luce elevata in un tempo molto breve. È stato ampiamente utilizzato nei casi in cui un tempo di trattamento più lungo è scomodo come aPDT per le infezioni orali. Lo svantaggio di un laser è che la sua dimensione spot di illuminazione è piccola, che va da poche centinaia di micrometri a 10 mm con un diffusore. Inoltre, le apparecchiature laser sono costose e richiedono una formazione specifica per funzionare. D’altra parte, l’area di irradiazione di una lampada alogena metallica con filtri è relativamente più grande13. Tuttavia, la lampada è troppo pesante e costosa. Le sorgenti luminose a LED sono diventate mainstream di aPDT in campo dermatologico perché è piccolo e meno costoso. L’area di irradiazione può essere relativamente grande con una disposizione array della lampadina a LED. L’intero viso può essere illuminato contemporaneamente9. Tuttavia, la maggior parte, se non tutte, le sorgenti luminose a LED disponibili oggi sono progettate per uso clinico. Potrebbe non essere adatto per esperimenti in un laboratorio perché occupa spazio e costoso. Abbiamo sviluppato un array di LED economico che è molto piccolo e può essere tagliato e assemblato da una striscia LED. I LED possono essere montati in diverse disposizioni per diversi progetti sperimentali. Diverse condizioni di aPDT possono essere completate in una piastra a 96 pozzetti o anche in una piastra a 384 pozzetti in un esperimento.
Rose bengal (RB) è un colorante colorato ampiamente utilizzato per migliorare la visualizzazione dei danni corneali negli occhi umani14. L’aPDT mediato da RB ha mostrato effetti di uccisione su Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans con un’efficienza approssimativamente paragonabile a quella del blu di Toluidina O15. Questo studio dimostra un metodo per convalidare l’effetto di RB-aPDT su C. albicans multiresistente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Risultati incoraggianti delle applicazioni cliniche di RB-PDT per la cheratite fungina sono stati riportati di recente19. Il picco di assorbimento di RB è a 450-650 nm. È essenziale determinare la frequenza di fluenza della sorgente luminosa per un aPDT di successo. Una fluenza elevata (di solito >100 J / cm2) è necessaria per trattare le cellule tumorali, mentre una fluenza inferiore dovrebbe trattare le lesioni infette6. Un’elevata fluenza significa un lungo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Center of Applied Nanomedicine, dalla National Cheng Kung University dal Featured Areas Research Center Program nell’ambito del Higher Education Sprout Project dal Ministero dell’Istruzione (MOE) e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] a TW Wong. J.H. Hung riconosce i finanziamenti del National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018] e [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | disperses heat from the LED array |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
