تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء وضع العلامات على البروتين الخاص بنوع الخلية باستخدام أزيدونونورليوسين (ANL) باستخدام خط ماوس يعبر عن سينثيتاز L274G-Methionine tRNA المتحور (MetRS *) والخطوات اللازمة لعزل البروتينات الخاصة بنوع الخلية الموصوفة. نحدد طريقين محتملين لإدارة ANL في الفئران الحية عن طريق (1) مياه الشرب و (2) الحقن داخل الصفاق.
Abstract
يعد فهم الاتزان الداخلي للبروتين في الجسم الحي أمرا أساسيا لمعرفة كيفية عمل الخلايا في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. يصف البروتوكول الحالي وضع العلامات في الجسم الحي والتنقية اللاحقة للبروتينات المركبة حديثا باستخدام خط فأر مهندس لتوجيه وضع العلامات على البروتين إلى مجموعات خلوية محددة. وهو خط قابل للتحريض عن طريق تعبير Cre recombinase ل L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS *) ، مما يتيح دمج أزيدونونورليوسين (ANL) في البروتينات ، والتي لن تحدث بخلاف ذلك. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، من الممكن تنقية البروتينات الخاصة بنوع الخلية المصنفة في الجسم الحي واكتشاف التغيرات الطفيفة في محتوى البروتين بسبب تقليل تعقيد العينة.
Introduction
يحدث توازن البروتين الشاذ بسبب اختلال التوازن في تخليق البروتين وتدهوره. ترتبط العديد من الأمراض بالتغيرات في توازن البروتين. السمة المميزة لبعض الأمراض هي وجود مجاميع في مواقع تحت خلوية مختلفة ومناطق الدماغ. الاتزان الداخلي للبروتين ليس مهما في المرض فحسب ، بل يلعب أيضا دورا مهما في الوظيفة الطبيعية للعضو والخلية1. على سبيل المثال ، تخليق البروتين ضروري للعديد من أشكال اللدونة العصبية 2,3 ، على النحو الذي يحدده استخدام مثبطات كيميائية تمنع تخليق البروتين4. ومع ذلك ، ليس من الواضح في أي أنواع الخلايا يتم تغيير البروتين لدعم التعلم والذاكرة ، ولا يفهم أي بروتينات معينة في كل نوع من أنواع الخلايا تزيد أو تنقص في تخليقها أو تدهورها. وبالتالي ، فإن الدراسة الشاملة لتوازن البروتين تتطلب القدرة على التمييز بين البروتينات القادمة من أنواع معينة من الخلايا. في الواقع ، كان تحديد البروتينات الخاصة بنوع الخلية لدراسة العمليات الخلوية التي تحدث في بيئة متعددة الخلايا عقبة مهمة في البروتيوميات. لهذا السبب ، قمنا بتطوير تقنية باستخدام تعبير MetRS * جنبا إلى جنب مع طرق التعامد الحيوي التي أثبتت أنها طريقة فعالة لتحديد وتنقية البروتينات المحددة من نوع الخلية ، وسد هذه الفجوة5،6،7.
يسمح التعبير عن MetRS * الطافر (MetRS L274G) بتحميل ANL التناظري للميثيونين غير الكنسي في tRNA 8,9 المقابل ودمجه لاحقا في البروتينات. عندما يتم تنظيم تعبير MetRS * بواسطة محفز خاص بنوع الخلية ، سيتم دمج الحمض الأميني غير المتعارف عليه في البروتينات بطريقة انتقائية للخلايا. بمجرد دمج ANL في البروتينات ، يمكن تشغيله بشكل انتقائي عن طريق كيمياء النقر وبعد ذلك إما عن طريق التصوير (FUNCAT) أو عن طريق Western Immunoblot (BONCAT). بدلا من ذلك ، يمكن تنقية البروتينات بشكل انتقائي وتحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي (MS). باستخدام هذه التقنية ، أنشأنا خط ماوس يعبر عن بروتين MetRS * تحت سيطرة Cre recombinase. بالنظر إلى العدد المتزايد من خطوط Cre-mouse المتاحة ، يمكن استخدام نظام MetRS * في أي مجال لدراسة أي نوع من الخلايا من أي نسيج يوجد له خط Cre-line موجود. يمكن وضع العلامات على البروتين باستخدام ANL في المختبر أو في الجسم الحي ، ولا يغير سلوك الماوس أو سلامة البروتين6. يمكن تكييف الفترة الزمنية لوضع العلامات مع السؤال العلمي لكل باحث ، ووضع العلامات على البروتينات المركبة حديثا (أوقات وضع العلامات الأقصر) أو البروتينات بأكملها (أوقات وضع العلامات الأطول). يقتصر استخدام هذه التقنية على عدد الخلايا من النوع الذي يرغب الباحث في دراسته ؛ ومن ثم فإن عزل البروتين عن أنواع الخلايا ذات الأعداد المنخفضة أو معدلات الأيض المنخفضة غير ممكن بهذه الطريقة. الهدف من الطريقة المقدمة هو تحديد البروتينات / البروتينات الخاصة بنوع الخلية المصنفة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، نصف كيفية تسمية البروتينات الخاصة بنوع الخلية باستخدام ANL في الفئران الحية وتنقية البروتينات المصنفة. بعد التنقية ، يمكن تحديد البروتينات من خلال بروتوكولات قياس الطيف الكتلي الروتينية 5,10. يسمح الحد من تعقيد العينة الذي تم تحقيقه في هذه الطريقة عن طريق التنقية الانتقائية للبروتينات من مجموعات خلوية محددة للمجرب باكتشاف التغيرات الطفيفة في البروتينات ، على سبيل المثال ، استجابة للتغيرات البيئية. يمكن تحقيق تنقية البروتينات الموسومة في ~ 10 أيام ، ولا تشمل تحليل MS أو فترة وضع العلامات. هنا ، نصف طريقتين لإدارة ANL للفئران المعبرة عن MetRS * ، وهما (1) إضافة الأحماض الأمينية في مياه الشرب ، و (2) إدخال ANL عن طريق الحقن داخل الصفاق. بغض النظر عن الطريقة المختارة لإدارة ANL ، فإن خطوات العزل والتنقية هي نفسها (من الخطوة 2 فصاعدا).
Protocol
Representative Results
Discussion
الجوانب الحاسمة للبروتوكول هي ؛ إدراج الضوابط السلبية ، وجود ما يكفي من التكرارات البيولوجية ، ومسار إدارة ANL ، والكمية ، والمدة ، وألكلة العينات ، وتركيز الألكين ، والقضاء على β-mercaptoethanol عند استخدام DST-alkyne.
من المهم تضمين عينات التحكم السلبية الناتجة عن الحيوانات التي تحمل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل B.A-C من قبل وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I) ، من قبل مجتمع مدريد المتمتع بالحكم الذاتي (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) ، ومنح MICINN (PID2020-113270RA-I00). يتم تمويل R. A-P من قبل مجتمع مدريد المستقل (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057). يتم تمويل E.M.S. من قبل جمعية ماكس بلانك ، وهي جائزة الباحث المتقدم من مجلس البحوث الأوروبي (منحة 743216) ، DFG CRC 1080: الآليات الجزيئية والخلوية للتوازن العصبي ، و DFG CRC 902: المبادئ الجزيئية للتنظيم القائم على الحمض النووي الريبي. نشكر DC Dieterich و P. Landgraf على نصائحهم الفنية وتوليف DST-Alkyne. نشكر E. Northrup و S. Zeissler و S. Gil Mast ومرفق الحيوانات في MPI لأبحاث الدماغ على دعمهم الممتاز. نشكر ساندرا جوبلز على مشاركة خط الماوس Nex-Cre. نشكر أنطونيو جي كاروجيو على مساعدته في تحرير اللغة الإنجليزية. بكالوريوس – ج. تصميم التجارب وإجرائها وتحليلها. B.N-A ، D.O.C ، R.A-P ، C. E. ، و S. T. د. إجراء التجارب وتحليلها. B.A-C و E.M.S. صممت التجارب ، وأشرفت على المشروع ، كتب B.A-C الورقة. قام جميع المؤلفين بتحرير الورقة.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
