Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante
Summary
Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l’isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.
Abstract
Comprendere l’omeostasi proteica in vivo è la chiave per sapere come funzionano le cellule sia in condizioni fisiologiche che di malattia. Il presente protocollo descrive la marcatura in vivo e la successiva purificazione di proteine di nuova sintesi utilizzando una linea di topi ingegnerizzata per indirizzare l’etichettatura delle proteine a specifiche popolazioni cellulari. È una linea inducibile dall’espressione di Cre ricombinasi della L274G-Metionina tRNA sintetasi (MetRS*), che consente l’incorporazione dell’azidonorleucina (ANL) nelle proteine, che altrimenti non si verificherebbe. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile purificare proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo e rilevare sottili cambiamenti nel contenuto proteico dovuti alla riduzione della complessità del campione.
Introduction
L’omeostasi delle proteine aberranti è causata da uno squilibrio nella sintesi e nella degradazione delle proteine. Diverse malattie sono correlate ad alterazioni nell’omeostasi proteica. Il segno distintivo di alcune malattie è la presenza di aggregati in diverse posizioni subcellulari e aree cerebrali. L’omeostasi proteica non è importante solo nella malattia, ma svolge anche un ruolo cruciale nella normale funzione degli organi e delle cellule1. Ad esempio, la sintesi proteica è necessaria per molte forme di plasticità neuronale2,3, come determinato dall’uso di inibitori chimici che bloccano la sintesi proteica4. Tuttavia, non è chiaro in quali tipi cellulari il proteoma sia alterato per supportare l’apprendimento e la memoria, né si capisce quali proteine specifiche in ciascun tipo di cellula aumentano o diminuiscono nella loro sintesi o degradazione. Pertanto, uno studio completo dell’omeostasi proteica richiede la capacità di differenziare i proteomi provenienti da specifici tipi di cellule. In effetti, l’identificazione di proteomi specifici del tipo di cellula per studiare i processi cellulari che si verificano in un ambiente multicellulare è stato un ostacolo importante nella proteomica. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza l’espressione di MetRS* combinata con metodi bio-ortogonali che si è dimostrata un modo efficace per identificare e purificare proteomi specifici del tipo cellulare, colmando questa lacuna 5,6,7.
L’espressione di un mutante MetRS* (MetRS L274G) permette il caricamento dell’analogo non canonico della metionina ANL nel corrispondente tRNA 8,9 e la sua successiva incorporazione nelle proteine. Quando l’espressione di MetRS* è regolata da un promotore specifico del tipo di cellula, l’amminoacido non canonico sarà incorporato nelle proteine in modo selettivo cellulare. Una volta che l’ANL è incorporato nelle proteine, può essere funzionalizzato selettivamente mediante click-chemistry e successivamente visualizzato mediante imaging (FUNCAT) o Western Immunoblot (BONCAT). In alternativa, le proteine possono essere purificate selettivamente e identificate mediante spettrometria di massa (MS). Utilizzando questa tecnologia, abbiamo creato una linea di topi che esprime la proteina MetRS* sotto il controllo della Cre ricombinasi. Considerando il crescente numero di linee Cre-mouse disponibili, il sistema MetRS* può essere utilizzato in qualsiasi campo per studiare qualsiasi tipo di cellula da qualsiasi tessuto per il quale esiste una linea Cre esistente. La marcatura delle proteine con ANL è possibile in vitro o in vivo e non altera il comportamento del topo o l’integrità delle proteine6. Il periodo di marcatura può essere adattato alla domanda scientifica di ciascun ricercatore, etichettando proteine di nuova sintesi (tempi di etichettatura più brevi) o interi proteomi (tempi di etichettatura più lunghi). L’uso di questa tecnica è limitato dal numero di cellule del tipo che il ricercatore è disposto a studiare; Quindi l’isolamento delle proteine da tipi cellulari con basso numero o bassi tassi metabolici non è possibile con questo metodo. L’obiettivo del metodo presentato è quello di identificare proteine/proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo. In questo protocollo, descriviamo come etichettare i proteomi specifici del tipo di cellula con ANL nei topi vivi e purificare le proteine marcate. Dopo la purificazione, le proteine possono essere identificate mediante protocolli di spettrometria di massa di routine 5,10. La riduzione della complessità del campione ottenuta in questo metodo mediante la purificazione selettiva di proteine da specifiche popolazioni cellulari consente allo sperimentatore di rilevare sottili cambiamenti nei proteomi, ad esempio, in risposta a cambiamenti ambientali. La purificazione delle proteine marcate può essere ottenuta in ~ 10 giorni, esclusa l’analisi della SM o il periodo di etichettatura. Qui, descriviamo due metodi per la somministrazione di ANL ai topi che esprimono MetRS*, vale a dire (1) aggiunta dell’amminoacido nell’acqua potabile e (2) introduzione di ANL mediante iniezioni intraperitoneali. Indipendentemente dal metodo scelto per la somministrazione di ANL, le fasi di isolamento e purificazione sono le stesse (dalla fase 2 in poi).
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli aspetti critici del protocollo sono; l’inclusione di controlli negativi, avere abbastanza repliche biologiche, via di somministrazione di ANL, quantità e durata, alchilazione dei campioni, concentrazione di alchine ed eliminazione del β-mercaptoetanolo quando si utilizza DST-alchini.
È fondamentale includere campioni di controllo negativi provenienti da animali marcati con ANL senza driver Cre e quindi senza espressione MetRS*. Questi campioni devono essere sottoposti a ogni fase descri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C è finanziato dal Ministero spagnolo della Scienza e dell’Innovazione (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) e dalle sovvenzioni MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P è finanziato dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. è finanziato dalla Max Planck Society, un premio Advanced Investigator del Consiglio europeo della ricerca (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis, e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Ringraziamo D.C Dieterich e P. Landgraf per la loro consulenza tecnica e la sintesi del DST-Alchine. Ringraziamo E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e la struttura animale dell’MPI for Brain Research per il loro eccellente supporto. Ringraziamo Sandra Goebbels per aver condiviso la linea di mouse Nex-Cre. Ringraziamo Antonio G. Carroggio per il suo aiuto con l’editing in inglese. B.A-C. progettato, condotto e analizzato esperimenti. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. ha condotto e analizzato esperimenti. B.A-C e E.M.S. progettarono esperimenti e supervisionarono il progetto, B.A-C scrisse il documento. Tutti gli autori hanno curato l’articolo.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
