טיהור וזיהוי חלבונים ספציפיים מסוג תא מרקמות מורכבות באמצעות קו עכברים מוטנטי מתיונין tRNA Synthetase
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תיוג חלבונים ספציפיים לסוג התא עם אזידונורלאוצין (ANL) באמצעות קו עכבר המבטא מוטציה L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*) ואת השלבים הדרושים לבידוד חלבונים ספציפיים לסוג התא המסומנים. אנו מתארים שני מסלולי מתן ANL אפשריים בעכברים חיים על ידי (1) מי שתייה ו-(2) זריקות תוך-צפקיות.
Abstract
הבנת הומאוסטזיס של חלבונים in vivo היא המפתח לדעת כיצד התאים פועלים הן במצב פיזיולוגי והן במצב של מחלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג in vivo וטיהור לאחר מכן של חלבונים מסונתזים חדשים באמצעות קו עכברים מהונדס כדי לכוון את תיוג החלבונים לאוכלוסיות תאיות ספציפיות. זהו קו אינדוקטיבי על ידי ביטוי Cre recombinase של L274G-מתיונין tRNA synthetase (MetRS*), המאפשר שילוב אזידונורלאוצין (ANL) לחלבונים, אשר אחרת לא יתרחש. באמצעות השיטה המתוארת כאן, ניתן לטהר פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo ולזהות שינויים עדינים בתכולת החלבון עקב הפחתת מורכבות הדגימה.
Introduction
הומאוסטזיס של חלבון Aberrant נגרמת על ידי חוסר איזון בסינתזת חלבונים והשפלה. מספר מחלות קשורות לשינויים בהומאוסטזיס חלבונים. סימן ההיכר של מחלות מסוימות הוא נוכחות של אגרגטים במקומות תת-תאיים שונים ובאזורי מוח. הומאוסטזיס של חלבונים לא רק חשוב במחלות, אלא גם ממלא תפקיד מכריע בתפקוד תקין של איברים ותאים1. לדוגמה, סינתזת חלבונים נחוצה לצורות רבות של פלסטיות עצבית2,3, כפי שנקבע על ידי שימוש במעכבים כימיים החוסמים את סינתזת החלבון4. עם זאת, לא ברור באילו סוגי תאים הפרוטאום משתנה כדי לתמוך בלמידה ובזיכרון, וגם לא מובן אילו חלבונים ספציפיים בכל סוג תא מגבירים או יורדים בסינתזה או בהתפרקות שלהם. לפיכך, מחקר מקיף של הומאוסטזיס חלבונים דורש את היכולת להבדיל פרוטאומים המגיעים מסוגי תאים ספציפיים. ואכן, זיהוי פרוטאומים ספציפיים לסוג התא כדי לחקור תהליכים תאיים המתרחשים בסביבה רב-תאית היה מכשול חשוב בפרוטאומיקה. מסיבה זו, פיתחנו טכניקה המשתמשת בביטוי MetRS* בשילוב עם שיטות ביו-אורתוגונליות שהוכחה כדרך יעילה לזהות ולטהר פרוטאומים ספציפיים מסוג תא, ולמלא את הפער הזה 5,6,7.
הביטוי של MetRS* מוטנטי (MetRS L274G) מאפשר טעינה של ה-ANL האנלוגי הלא-קנוני מתיונין לתוך ה-tRNA 8,9 המתאים ושילובו לאחר מכן בחלבונים. כאשר ביטוי MetRS* מווסת על ידי מקדם ספציפי לסוג התא, חומצת האמינו הלא-קנונית תשולב בחלבונים באופן סלקטיבי של התא. ברגע ש-ANL משולב בחלבונים, הוא יכול לתפקד באופן סלקטיבי על ידי כימיה של קליקים ולאחר מכן על ידי הדמיה (FUNCAT) או על ידי Western Immunoblot (BONCAT). לחלופין, חלבונים יכולים להיות מטוהרים באופן סלקטיבי ומזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). באמצעות טכנולוגיה זו, יצרנו קו עכבר המבטא את החלבון MetRS* תחת שליטה של רקומבינאז Cre. בהתחשב במספר ההולך וגדל של קווי Cre-mouse הזמינים, ניתן להשתמש במערכת MetRS* בכל תחום כדי לחקור כל סוג תא מכל רקמה שעבורה קיים קו Cre. תיוג חלבונים עם ANL אפשרי במבחנה או in vivo, ואינו משנה את התנהגות העכבר או את שלמות החלבון6. ניתן להתאים את זמן התיוג לשאלה המדעית של כל חוקר, לתייג חלבונים מסונתזים חדשים (זמני תיוג קצרים יותר) או פרוטאומים שלמים (זמני תיוג ארוכים יותר). השימוש בטכניקה זו מוגבל על ידי מספר התאים מהסוג שהחוקר מוכן ללמוד; מכאן שבידוד חלבונים מסוגי תאים עם מספרים נמוכים או קצבי חילוף חומרים נמוכים אינו אפשרי בשיטה זו. מטרת השיטה המוצגת היא לזהות חלבונים/פרוטאומים ספציפיים לסוג התא המסומנים in vivo. בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לתייג פרוטאומים ספציפיים לתאים עם ANL בעכברים חיים ולטהר את החלבונים המסומנים. לאחר הטיהור, ניתן לזהות חלבונים על ידי פרוטוקולים שגרתיים של ספקטרומטריית מסה 5,10. הפחתת מורכבות הדגימה המושגת בשיטה זו על ידי טיהור סלקטיבי של חלבונים מאוכלוסיות תאים ספציפיות מאפשרת לנסיין לזהות שינויים עדינים בפרוטאומים, למשל, בתגובה לשינויים סביבתיים. טיהור החלבונים המסומנים יכול להיות מושג תוך ~ 10 ימים, לא כולל ניתוח הטרשת הנפוצה או תקופת התיוג. במאמר זה נתאר שתי שיטות למתן ANL ל-MetRS* המבטאות עכברים, כלומר (1) הוספת חומצת האמינו במי השתייה, ו-(2) החדרת ANL באמצעות זריקות תוך-צפקיות. ללא קשר לשיטה שנבחרה לניהול NAL, שלבי הבידוד והטיהור זהים (משלב 2 ואילך).
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול הם; הכללת בקרות שליליות, שיש מספיק שכפולים ביולוגיים, מסלול ניהול ANL, כמות ומשך, אלקילציה של הדגימות, ריכוז אלקין, וחיסול β-מרקפטואתנול בעת שימוש ב- DST-alkyne.
המפתח הוא לכלול דגימות בקרה שליליות הנובעות מבעלי חיים המסומנים ב-ANL ללא נהג Cre ולכן ללא ביט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C ממומן על ידי מענקי משרד המדע והחדשנות הספרדי (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057), ומענקי MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P ממומן על ידי הקהילה האוטונומית של מדריד (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. ממומן על ידי אגודת מקס פלנק, פרס חוקר מתקדם מטעם המועצה האירופית למחקר (מענק 743216), DFG CRC 1080: מנגנונים מולקולריים ותאיים של הומאוסטזיס עצבי, ו- DFG CRC 902: עקרונות מולקולריים של ויסות מבוסס RNA. אנו מודים ל- D.C Dieterich ו- P. Landgraf על הייעוץ הטכני שלהם ועל הסינתזה של שעון הקיץ-אלקין. אנו מודים ל- E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast, ולמתקן החיות של MPI לחקר המוח על תמיכתם המצוינת. אנו מודים לסנדרה גבלס על שיתוף קו העכבר Nex-Cre. אנו מודים לאנטוניו ג ‘קרוג’יו על עזרתו בעריכה באנגלית. B.A-C. תכננו, ערכו ונותחו ניסויים. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., ו- S. t. ד. ערך וניתח ניסויים. B.A-C ו-E.M.S. תכננו ניסויים, ופיקחו על הפרויקט, B.A-C כתבו את המאמר. כל המחברים ערכו את המאמר.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
